Informacja

Na wykresie Lineweaver-Burk, dlaczego przecięcie osi x = -1/Km?


Biorąc odwrotność obu stron równania Michaelisa-Mentena, otrzymujemy równanie Lineweavera-Burka:

$ dfrac{1}{V} = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}+ dfrac{1}{V_{max}} $

Wykreślając wykres $ dfrac{1}{V}$ vs. $dfrac{1}{[S]}$, powiedziano mi, że:

y-int $= dfrac{1}{V_{max}}$ i

x-int $= -dfrac{1}{K_m}$

Jak te relacje wywodzą się z fabuły tkacza-Burka? Widzę, że punkt przecięcia y może być równy $dfrac{1}{V_{max}}$, jeśli $dfrac{1}{[S]} = 0$, ale nie widzę, jak x- int $= -dfrac{1}{K_m}$ przez ustawienie $dfrac{1}{V} = 0$? Czy ktoś może zademonstrować, w jaki sposób powstały te relacje?


Ustaw $ dfrac{1}{V} = 0$ i rozwiąż $dfrac{1}{[S]}$:

0 $ = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}+ dfrac{1}{V_{max}} $

$ -dfrac{1}{V_{max}} = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}$

$ -1 = {K_m}dfrac{1}{[S]}$

$ -dfrac{1}{K_m} = dfrac{1}{[S]} = $ x-intercept


10.5: Hamowanie enzymów

Enzymy można regulować w sposób, który promuje lub zmniejsza ich aktywność. Istnieje wiele różnych rodzajów cząsteczek, które hamują lub promują działanie enzymów i istnieją różne mechanizmy, które to umożliwiają. Na przykład w niektórych przypadkach hamowania enzymu cząsteczka inhibitora jest na tyle podobna do substratu, że może wiązać się z miejscem aktywnym i po prostu blokować wiązanie substratu. Kiedy tak się dzieje, enzym jest hamowany poprzez inhibicję kompetycyjną, ponieważ cząsteczka inhibitora konkuruje z substratem o wiązanie miejsca aktywnego. Z drugiej strony, w hamowaniu niekompetycyjnym, cząsteczka inhibitora wiąże się z enzymem w miejscu innym niż miejsce allosteryczne i nadal udaje się zablokować wiązanie substratu z miejscem aktywnym.


Biochemia: kinetyka i hamowanie enzymów

Przy jakiej wartości na wykresie kinetyki enzymu występuje stała Michaelisa ?

Podano za mało informacji, aby przewidzieć

Stała Michaelisa, , jest często stosowaną wartością w kinetyce enzymów, służącą zasadniczo do opisania ilości substratu potrzebnej do przyspieszenia reakcji. Dokładniej, jest to stężenie substratu wymagane do uzyskania reakcji na jego połowę (prawidłowa odpowiedź to ). Sama jest podana jako specyficzne stężenie substratu i aby je znaleźć, należy narysować linię prostą w poprzek na wykresie kinetyki enzymu aż do osiągnięcia krzywej. Stężenie substratu znalezione w tym punkcie to .

Przykładowe pytanie nr 1: Vmax i Km

Które z nich są reprezentacjami ?

III. Przecięcie Y na działce Lineweaver-Burk

Jednak na wykresie Lineweaver-Burk, Y-przecięcie faktycznie reprezentuje . Jest to punkt przecięcia osi X, z którego można wyprowadzić. Przecięcie X jest równoważne .

Przykładowe pytanie nr 1: Vmax i Km

Kiedy enzym znajduje się w obecności konkurencyjnego inhibitora, co stanie się z enzymem?

Inhibitory konkurencyjne zablokują miejsce aktywne enzymu. Obecność konkurencyjnego inhibitora zwiększa ilość substratu wymaganą do uzyskania enzymu do połowy jego maksymalnej prędkości. W rezultacie zwiększy się ilość enzymu. Należy zauważyć, że konkurencyjny inhibitor nie wpłynie na maksymalną prędkość enzymu.

Przykładowe pytanie nr 1: Krok ograniczania szybkości

Według kinetyki Michaelisa-Mentona, co jest charakterystyczne dla etapu ograniczającego szybkość w kinetyce enzymów?

Dysocjuje kompleks enzym-substrat na enzym + substrat

Powstaje kompleks enzym-substrat

Zależy od energii aktywacji z katalizy

Nie obejmuje katalizatora

Zależy od energii aktywacji z katalizy

Kompleks enzym-substrat dysocjuje na enzym + produkt. Etapem ograniczającym szybkość jest dostarczenie energii aktywacji, aby przejść do stanu przejściowego, który jest znacznie zmniejszany przez enzym.

Przykładowe pytanie nr 2: Krok ograniczania szybkości

Które z poniższych najlepiej opisuje etap ograniczania szybkości reakcji chemicznej?

Jest to krok, który uwalnia największą ilość energii w całej reakcji

Jest to krok, który zużywa najwięcej energii w całej reakcji

To najszybszy krok w całej reakcji

To zawsze reakcja anaboliczna

To najwolniejszy etap całej reakcji

To najwolniejszy etap całej reakcji

Chociaż reakcje chemiczne są zwykle przedstawiane w postaci równania, z reagentami po lewej stronie i produktami po prawej, reakcje te nie są prostą jednoetapową konwersją. Często istnieje kilka indywidualnych etapów, przez które przechodzą reagenty na drodze do stania się produktami. Wskazuje na to mechanizm tej konkretnej reakcji.

Co więcej, mówiąc o reakcjach chemicznych, bardzo ważne jest rozróżnienie dwóch pojęć, które czasami są ze sobą mylone. Pierwsza dotyczy kinetyki reakcji, druga termodynamiki.

Kinetyka chemiczna dotyczy czasu. Jeśli zachodzi reakcja chemiczna, kinetyka odpowiada na pytanie, jak szybko przebiega reakcja. Z drugiej strony termodynamika nie dotyczy czasu. Nie obchodzi go, jak szybko lub jak wolno przebiega reakcja. Obchodzi go tylko to, czy reakcja chemiczna jest spontaniczna, czy niespontaniczna. Aby odpowiedzieć na to pytanie, termodynamika rozważa energetykę reakcji.

Patrząc na wybory odpowiedzi, na podstawie tych informacji możemy od razu wyeliminować trzy z nich. Etap ograniczania szybkości reakcji chemicznej nie dotyczy tego, ile energii jest uwalniane lub zużywane. Zamiast tego etap ograniczający szybkość definiuje się jako najwolniejszy etap spośród wszystkich etapów zachodzących w danej reakcji chemicznej. Innymi słowy, reakcja może przebiegać tak szybko, jak jej najwolniejszy krok, tak jak łańcuch jest tak silny, jak jego najsłabsze ogniwo. Ponadto etap ograniczający szybkość reakcji może być anaboliczny lub kataboliczny.

Należy jednak zauważyć, że istnieje jeden składnik energii, który wpływa na szybkość reakcji. Ta energia nazywa się energia aktywacji, i przedstawia, ile energii należy zainwestować w reakcję, aby ta reakcja przebiegała. Powodem, dla którego jest to odmienne od termodynamiki, jest jednak to, że termodynamika dba tylko o początkowe i końcowe stany energii, nie dba o to, jak reakcja przechodzi od początkowego do końcowego, podczas gdy kinetyka tak. Nawet jeśli energia aktywacji reakcji może się zmienić (na przykład za pośrednictwem enzymów), nie wpłynie to na początkowy i końcowy poziom energii.


Skarga DMCA

Jeśli uważasz, że treści dostępne za pośrednictwem Witryny (zgodnie z definicją w naszych Warunkach świadczenia usług) naruszają co najmniej jedno z Twoich praw autorskich, poinformuj nas o tym, przesyłając pisemne zawiadomienie („Powiadomienie o naruszeniu”) zawierające informacje opisane poniżej do wyznaczonego agenta wymienionego poniżej. Jeśli Varsity Tutors podejmie działania w odpowiedzi na powiadomienie o naruszeniu, podejmie w dobrej wierze próbę skontaktowania się ze stroną, która udostępniła takie treści za pomocą najnowszego adresu e-mail, jeśli taki istnieje, dostarczonego przez tę stronę Varsity Tutors.

Twoje powiadomienie o naruszeniu może zostać przekazane stronie, która udostępniła treść lub stronom trzecim, takim jak ChillingEffects.org.

Informujemy, że poniesiesz odpowiedzialność za szkody (w tym koszty i honoraria prawników), jeśli oświadczysz niezgodnie z prawdą, że produkt lub działanie narusza Twoje prawa autorskie. W związku z tym, jeśli nie masz pewności, że treści znajdujące się w Witrynie lub do których prowadzą linki naruszają Twoje prawa autorskie, powinieneś rozważyć najpierw skontaktowanie się z prawnikiem.

Wykonaj następujące kroki, aby złożyć zawiadomienie:

Musisz podać następujące informacje:

Fizyczny lub elektroniczny podpis właściciela praw autorskich lub osoby upoważnionej do działania w jego imieniu Identyfikacja praw autorskich, które rzekomo zostały naruszone Opis charakteru i dokładnej lokalizacji treści, które Twoim zdaniem naruszają Twoje prawa autorskie, w wystarczającym szczegóły, aby umożliwić nauczycielom szkół wyższych znalezienie i pozytywne zidentyfikowanie tej treści, na przykład wymagamy linku do konkretnego pytania (nie tylko nazwy pytania), który zawiera treść i opis, która konkretna część pytania – obraz, link, tekst itp. – Twoja skarga dotyczy Twojego imienia i nazwiska, adresu, numeru telefonu i adresu e-mail oraz Oświadczenia z Twojej strony: (a) że uważasz w dobrej wierze, że wykorzystanie treści, które Twoim zdaniem narusza Twoje prawa autorskie, jest upoważniony przez prawo lub przez właściciela praw autorskich lub agenta takiego właściciela (b) że wszystkie informacje zawarte w powiadomieniu o naruszeniu prawa są dokładne i (c) pod karą krzywoprzysięstwa, że ​​jesteś albo właściciel praw autorskich lub osoba upoważniona do działania w jego imieniu.

Wyślij skargę do naszego wyznaczonego agenta na adres:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, apartament 300
Louis, MO 63105


Reakcje heterogeniczne

13.9 Ocena rzeczywistych parametrów kinetycznych

Wewnętrzna kinetyka reakcji zerowego rzędu, pierwszego rzędu i reakcji Michaelisa-Mentena jest reprezentowana przez parametry k0, k1, oraz vmaks oraz Km. Generalnie nie można zakładać, że wartości tych parametrów będą takie same przed i po unieruchomieniu komórki lub enzymu: znaczące zmiany mogą zostać wprowadzone podczas procesu unieruchomienia. Jako przykład, Rysunek 13.20 pokazuje wykresy Lineweaver-Burk (sekcja 12.4.2) dla wolnych i unieruchomionych β-enzym galaktozydaza. Zgodnie z równaniem (12.43) , nachylenia i przecięcia linii na rysunku 13.20 wskazują wartości Km/vmaks i 1/vmaks, odpowiednio. W porównaniu z wynikami przedstawionymi dla wolnego enzymu, bardziej strome spadki i wyższe punkty przecięcia uzyskane dla unieruchomionego enzymu wskazują, że unieruchomienie zmniejsza vmaks jest to powszechnie obserwowany wynik. Wartość Km może to mieć również wpływ [9] .

Rysunek 13.20. Działki Lineweaver-Burka za darmo i unieruchomione β-galaktozydaza. Stężenia enzymów w żelu wynoszą: 0,10 mg ml -1 (●) 0,17 mg ml -1 (□) i 0,50 mg ml -1 (■).

Dane z P.S. Trznadel i K.J. Laidler, 1972, Badania kinetyczne nad β-galaktozydazą na nośniku stałym. Biochemia 11, 4477–4483.

Jak opisano w sekcjach 12.3 i 12.4, sekcja 12.3, sekcja 12.4, parametry kinetyczne dla reakcji jednorodnych można określić bezpośrednio z danych dotyczących szybkości eksperymentalnej. Jednak ocena prawdziwych parametrów kinetycznych unieruchomionych komórek i enzymów jest nieco trudniejsza. Obserwowana szybkość reakcji nie jest rzeczywistą szybkością we wszystkich punktach procesów przenoszenia masy katalizatora, skutecznie „maskując” prawdziwe zachowanie kinetyczne. Odpowiednio, vmaks oraz Km dla katalizatorów unieruchomionych nie można oszacować za pomocą klasycznych wykresów opisanych w sekcji 12.4. Pod wpływem transferu masy wykresy te nie dają już linii prostych w całym zakresie stężeń substratów [40, 41] .

Jak pokazano na rysunku 13.20 dla β-galaktozydaza, wykresy Lineweavera-Burka dla unieruchomionych enzymów są nieliniowe. Często jednak na takich wykresach odchylenie od liniowości jest przesłonięte przez rozrzut rzeczywistych danych eksperymentalnych i zniekształcenie błędów spowodowane linearyzacją Lineweaver-Burka (sekcje 12.4.2 i 3.3.4, sekcja 12.4.2, sekcje 3.3.4 ) . Przy niskich stężeniach substratu (tj. dużych wartościach 1/s), wykres Lineweavera-Burka wydaje się liniowy, ponieważ reakcja wykazuje przybliżoną kinetykę pierwszego rzędu. Wnioskując zatem, widocznej liniowości Lineweaver-Burk lub podobnych wykresów nie można uznać za wystarczający dowód braku ograniczeń transferu masy. Nawet jeśli błędnie zinterpretujemy jedną z krzywych unieruchomionych enzymów na rysunku 13.20 jako linię prostą i ocenimy pozorne wartości vmaks oraz Km, możemy sprawdzić, czy znaleźliśmy prawdziwe parametry kinetyczne, zmieniając promień cząstki i stężenie substratu w szerokim zakresie wartości. Rzeczywiste parametry kinetyczne enzymu nie zmieniają się w tych warunkach, które wpływają na przenoszenie masy do katalizatora. Dlatego też, jeśli nachylenie i/lub przecięcie zmienia się wraz z modułem Thiele, jak pokazano na Figurze 13.20, wkrótce staje się oczywiste, że system podlega ograniczeniom dyfuzyjnym. Badania wykazały, że efekty dyfuzji są bardziej wyraźne na wykresach Eadie-Hofstee niż na wykresach Lineweaver-Burk lub Langmuir, jednak wszystkie trzy dla unieruchomionych enzymów można przybliżyć liniami prostymi w pewnych odstępach czasu.

Chociaż działki Lineweaver-Burk dla unieruchomionych β-galaktozydaza są nieliniowe na Ryc. 13.20, nie powinniśmy wnioskować, że unieruchomiony enzym nie jest zgodny z kinetyką Michaelisa-Mentena. Kinetyczna forma reakcji na ogół utrzymuje się po unieruchomieniu komórek i enzymów [9] . Nieliniowość wykresów Lineweavera-Burka wynika natomiast z wpływu przenoszenia masy na mierzoną szybkość reakcji.

Zaproponowano kilka metod określania vmaks oraz Km w katalizatorach heterogenicznych [40–43] . Najprostsze podejście jest eksperymentalne: obejmuje zmniejszenie wielkości cząstek i obciążenia katalizatora oraz zwiększenie zewnętrznej prędkości cieczy w celu wyeliminowania wszystkich oporów przenoszenia masy. Zmierzone dane dotyczące szybkości można następnie analizować pod kątem parametrów kinetycznych, tak jakby reakcja była jednorodna. Jednakże, ponieważ zwykle bardzo trudne lub niemożliwe jest całkowite usunięcie efektów wewnątrzcząstkowego transferu masy, zaproponowano również procedury obejmujące szereg eksperymentów połączonych z analizą teoretyczną. W tych metodach dane dotyczące szybkości są zbierane przy wysokich i niskich stężeniach substratu przy użyciu różnych rozmiarów cząstek. Przy wysokich poziomach substratu zakłada się, że reakcja jest rzędu zerowego z ηi=1 przy niskich stężeniach substratu, zakłada się kinetykę pierwszego rzędu. Te założenia upraszczają analizę, ale nie zawsze mogą być prawdziwe.

Gdy dostępne są odpowiednie urządzenia obliczeniowe, prawdziwe wartości vmaks oraz Km można wyodrębnić z danych o ograniczonej dyfuzji przy użyciu obliczeń iteracyjnych opartych na całkowaniu numerycznym i regresji nieliniowej [7, 9]. Wiele pętli iteracyjnych może być wymaganych przed osiągnięciem zbieżności do końcowych wartości parametrów.


Na wykresie Lineweaver-Burk, dlaczego przecięcie osi x = -1/Km? - Biologia

Pytanie: 21) Inhibitory typu mieszanego wpłyną na ________ roku: 2008157

21) Inhibitory typu mieszanego wpływają na ________ reakcji enzymatycznej.

22) Typ inhibitora, który wiąże się z enzymem (E), ale nie z kompleksem enzym-substrat (ES), to (n) ________ inhibitor.

23) Które z poniższych jest? nie prawda o interakcji enzym-substrat?

A) Wiele enzymów jest wyjątkowo specyficznych w odniesieniu do substratu.

B) Wiele enzymów nie może rozpoznać stereoizomeru swojego substratu.

C) Niektóre enzymy akceptują dowolny z całej grupy substratów.

D) Karboksypeptydaza rozpoznaje dowolny z aminokwasów z końca karboksylowego polipeptydu.

E) Komórki często są w stanie wykonywać aktywność metaboliczną przy użyciu zaledwie kilku enzymów.

A) zaproponował Hans Buchner.

B) obejmuje zmianę konformacyjną kształtu enzymu.

C) jest również nazywany modelem zamka i klucza.

D) stwierdza, że ​​oddziaływania enzym-substrat są sztywne.

E) sugeruje, że podczas wiązania substratu powstają bardzo silne wiązania kowalencyjne.

25) Dlaczego wykres Lineweaver—Burk jest ważny w kinetyce enzymów?

A) Jest to działka jedno-wzajemna.

B) Ilustruje specyficzność enzymatyczną.

C) Ujawnia obecność grup protetycznych w enzymach.

D) Ułatwia ustalenie V max .

26) Stała Michaelisa

A) można określić za pomocą wykresu Lineweaver—Burk.

B) jest równe dwukrotności V max .

C) jest równe stężeniu substratu w V max /2.

27) Które z poniższych zdań dokładnie opisuje fabułę Lineweaver—Burk?

A) Jest to działka o podwójnej wzajemności.

B) tak punkt przecięcia jest równy 1/ V max .

C) x punkt przecięcia to -1/ K m .

E) Jej nachylenie jest takie samo jak na działce Eadie—Hofstee.

28) Która z poniższych zmiennych jest częścią równania Michaelisa—Mentena?

29) Nasycenie można zdefiniować jako

A) denaturacja enzymu.

B) niemożność zwiększenia szybkości reakcji poza skończoną górną granicę.

C) hamowanie funkcji enzymu przez blokowanie miejsca aktywnego.

D) stężenie substratu, przy którym prędkość osiąga połowę maksymalnej prędkości.


Na wykresie Lineweaver-Burk, dlaczego przecięcie osi x = -1/Km? - Biologia

W naszym obecnym rozdziale skupiliśmy się na sposobie, w jaki komórki są w stanie przeprowadzić reakcje niezbędne do życia. Zaczęliśmy od omówienia rodzajów enzymów, z którymi możesz się spotkać w Dniu Testu, zanim omówimy termodynamikę i kinetykę w odniesieniu do enzymów, które są katalizatorami biologicznymi. Następnie omówiliśmy analizę danych kinetycznych za pomocą dwóch różnych typów wykresów i rozmawialiśmy o kooperatywności. Ponieważ katalizatory są na ogół najbardziej aktywne w swoim naturalnym środowisku, rozważyliśmy wpływ temperatury, pH i zasolenia na ich aktywność. Wszystkie te prawdopodobnie pojawią się w dniu testu.

Enzymy wymagają regulacji, przeanalizowaliśmy podstawy mechanizmów sprzężenia zwrotnego. Mówiliśmy o inhibitorach enzymów, które mogą być odwracalne lub nieodwracalne. Różnica między rodzajami odwracalnego hamowania jest kluczową koncepcją Dnia Testu. Na koniec omówiliśmy zmiany w aktywności enzymów, które mogą obejmować aktywację allosteryczną, modyfikację kowalencyjną lub rozszczepienie nieaktywnych zymogenów. Przejdźmy teraz do omówienia nieenzymatycznych funkcji białek. Zauważysz wiele paraleli między nowym materiałem a koncepcjami opisanymi w tym rozdziale, takich jak powinowactwo wiązania. Pod koniec następnego rozdziału będziesz gotowy stawić czoła każdemu pytaniu o białko, które MCAT może rzucić na Ciebie!

Podsumowanie koncepcji

Enzymy jako katalizatory biologiczne

&środkowa kropkaEnzymy są katalizatorami biologicznymi, które są niezmienione w wyniku katalizowanych przez nie reakcji i nadają się do ponownego użycia.

·&emspKażdy enzym katalizuje pojedynczą reakcję lub typ reakcji o wysokiej specyficzności.

o Oksydoreduktazy katalizują reakcje utleniania-redukcji, które obejmują przenoszenie elektronów.

o Transferazy przenieść grupę funkcyjną z jednej cząsteczki do drugiej.

o Hydrolazy katalizować rozszczepienie dodatkiem wody.

o Lyases katalizować rozszczepienie bez dodatku wody i bez przenoszenia elektronów. Odwrotna reakcja (synteza) jest często ważniejsza z biologicznego punktu widzenia.

o Izomerazy katalizują interkonwersję izomerów, w tym zarówno izomerów konstytucyjnych, jak i stereoizomerów.

o Ligazy odpowiadają za połączenie dwóch dużych biomolekuł, często tego samego typu.

&środkowa kropkaReakcje egzoergiczne uwolnij energię i deltęg jest ujemny.

·&emspEnzymy obniżają energię aktywacji niezbędną do reakcji biologicznych.

·&emspEnzymy nie zmieniająenergii swobodnej (&Deltag) lub entalpii (&Deltah) zmiany towarzyszącej reakcji ani końcowej pozycji równowagi, raczej zmieniają szybkość (kinetykę), w której równowaga jest osiągana.

Mechanizmy aktywności enzymatycznej

·&emspEnzymy działają poprzez stabilizację stanu przejściowego, zapewniając korzystne mikrośrodowisko lub wiązanie z cząsteczkami substratu.

·&emspEnzymy mają aktywna strona, który jest miejscem katalizy.

·&emspPowiązanie z aktywną witryną jest wyjaśnione przez teoria zamka i klucza albo model dopasowania indukowanego.

o Teoria zamka i klucza zakłada, że ​​enzym i substrat są dokładnie komplementarne.

o Model indukowanego dopasowania zakłada, że ​​enzym i substrat przechodzą zmiany konformacyjne, aby w pełni oddziaływać.

·&emspNiektóre enzymy wymagają kationów metali kofaktory lub małe organiczne koenzymy aby być aktywnym.

Kinetyka enzymatyczna

·&emspEnzymy doświadczenie kinetyka nasycenia: wraz ze wzrostem stężenia substratu szybkość reakcji rośnie, aż do osiągnięcia maksymalnej wartości.

&środkowa kropkaMichaelis-Menten oraz Tkacz-Burk wykresy przedstawiają tę zależność odpowiednio jako hiperbolę i linię.

·&emspEnzymy można porównać na podstawie ich Km oraz vmaks wartości.

&środkowa kropkaEnzymy współpracujące wykazują krzywą sigmoidalną ze względu na zmianę aktywności z wiązaniem substratu.

Wpływ warunków lokalnych na aktywność enzymatyczną

·&emspTemperatura i pH wpływają na aktywność enzymu in vivo zmiany temperatury i pH mogą powodować denaturację enzymu i utratę aktywności z powodu utraty struktury drugorzędowej, trzeciorzędowej lub, jeśli występuje, czwartorzędowej.

&środkowa kropkaIn vitro, zasolenie może wpływać na działanie enzymów.

Regulacja aktywności enzymatycznej

·&emspŚcieżki enzymatyczne są silnie regulowane i podlegają inhibicji i aktywacji.

&środkowa kropkaHamowanie sprzężenia zwrotnego jest mechanizmem regulacyjnym, dzięki któremu aktywność katalityczna enzymu jest hamowana przez obecność wysokich poziomów produktu w dalszej części tego samego szlaku.

&środkowa kropkaOdwracalne hamowanie charakteryzuje się zdolnością do zastąpienia inhibitora związkiem o większym powinowactwie lub usunięcia go przy zastosowaniu łagodnej obróbki laboratoryjnej.

o Hamowanie konkurencyjne powstaje, gdy inhibitor jest podobny do substratu i wiąże się w miejscu aktywnym. Inhibicję konkurencyjną można przezwyciężyć przez dodanie większej ilości substratu. vmaks jest bez zmian, Km wzrasta.

o Niekonkurencyjne hamowanie powstaje, gdy inhibitor wiąże się z równym powinowactwem z enzymem i kompleksem enzym-substrat. vmaks zmniejsza się, Km pozostaje bez zmian.

o Mieszane hamowanie powstaje, gdy inhibitor wiąże się z nierównym powinowactwem do enzymu i kompleksu enzym-substrat. vmaks zmniejsza się, Km zwiększa się lub zmniejsza w zależności od tego, czy inhibitor ma wyższe powinowactwo do enzymu lub kompleksu enzym-substrat.

o Niekonkurencyjne hamowanie powstaje, gdy inhibitor wiąże się tylko z kompleksem enzym-substrat. Km oraz vmaks oba spadają.

&środkowa kropkaNieodwracalne zahamowanie zmienia enzym w taki sposób, że miejsce aktywne jest niedostępne przez dłuższy czas lub muszą zostać zsyntetyzowane na stałe nowe cząsteczki enzymu, aby reakcja zaszła ponownie.

·&emspEnzymy regulacyjne mogą doświadczać zarówno aktywacji, jak i hamowania.

o Allosteryczny miejsca mogą być zajęte przez aktywatory, które zwiększają powinowactwo lub obrót enzymatyczny.

o Fosforylacja (modyfikacja kowalencyjna fosforanem) lub glikozylacja (modyfikacja kowalencyjna węglowodanem) może zmienić aktywność lub selektywność enzymów.

o Zymogeny są wydzielane w formie nieaktywnej i aktywowane przez rozszczepienie.

Odpowiedzi na weryfikację koncepcji

1. Katalizatory charakteryzują się dwiema głównymi właściwościami: zmniejszają energię aktywacji reakcji, co przyspiesza reakcję, oraz nie zużywają się w trakcie reakcji. Enzymy poprawiają środowisko, w którym zachodzi dana reakcja, co obniża jej energię aktywacji. Regenerują się również pod koniec reakcji do swojej pierwotnej postaci.

2. Specyficzność enzymatyczna odnosi się do idei, że dany enzym katalizuje tylko daną reakcję lub rodzaj reakcji. Na przykład, kinazy białkowe specyficzne dla seryny/treoniny tylko umieści grupę fosforanową na grupie hydroksylowej reszty seryny lub treoniny.

Reakcje addycji lub syntezy, zazwyczaj między dużymi cząsteczkami, często wymagają ATP

Przegrupowanie wiązań w związku

Rozszczepienie pojedynczej cząsteczki na dwa produkty, czyli synteza małych cząsteczek organicznych

Rozbicie związku na dwie cząsteczki za pomocą dodatku wody

Oksydoreduktaza

Reakcje utleniania-redukcji (przenoszenie elektronów)

Transferaza

Ruch grupy funkcyjnej z jednej cząsteczki do drugiej

4. Enzymy nie mają wpływu na ogólną termodynamikę reakcji nie mają wpływu na &Deltag lub &Deltah reakcji, chociaż obniżają energię stanu przejściowego, tym samym obniżając energię aktywacji. Jednak enzymy mają głęboki wpływ na kinetykę reakcji. Obniżając energię aktywacji, równowagę można osiągnąć szybciej (chociaż pozycja równowagi się nie zmienia).

Zamek i klucz

Indukowane dopasowanie

·&emspAktywne miejsce enzymu pasuje dokładnie do substratu

·&emspBrak zmian w trzeciorzędowej lub czwartorzędowej strukturze enzymu

·&emspAktywne miejsce enzymu formuje się wokół substratu tylko wtedy, gdy substrat jest obecny

·&emspstruktura trzeciorzędowa i czwartorzędowa została zmodyfikowana, aby enzym działał

2. Kofaktory i koenzymy działają jako aktywatory enzymów. Kofaktory są zwykle nieorganiczne (minerały), podczas gdy koenzymy są zwykle małymi związkami organicznymi (witaminy). W obu przypadkach te regulatory wywołują zmianę konformacyjną enzymu, która promuje jego aktywność. Ściśle związane kofaktory lub koenzymy, które są niezbędne do funkcjonowania enzymu, są nazywane grupami prostymi.

1. Zwiększenie [S] ma różne efekty, w zależności od tego, ile substratu jest na początku. Gdy stężenie substratu jest niskie, wzrost [S] powoduje proporcjonalny wzrost aktywności enzymu. Jednak przy wysokim [S], gdy enzym jest nasycony, zwiększenie [S] nie ma wpływu na aktywność, ponieważ vmaks została już osiągnięta.
Zwiększenie [E] zawsze będzie wzrastać vmaks, niezależnie od wyjściowego stężenia enzymu.

2. Zarówno relacje Michaelis-Menten, jak i Lineweaver-Burk uwzględniają wartości Km oraz vmaks w różnych warunkach. Oba zapewniają proste graficzne interpretacje tych dwóch zmiennych i wywodzą się z równania Michaelisa-Mentena. Jednak osie tych wykresów i wizualna reprezentacja tych informacji różnią się między nimi. Działka Michaelisa-Mentena jest v vs. [S], który tworzy krzywą hiperboliczną dla enzymów monomerycznych. Z drugiej strony, fabuła Lineweaver-Burk jest vs. , który tworzy linię prostą.

3. Km jest miarą powinowactwa enzymu do jego substratu i jest definiowana jako stężenie substratu, gdy enzym działa z połową swojej maksymalnej prędkości. Jak Km wzrasta, maleje powinowactwo enzymu do jego substratu.

4. x-przechwytywanie reprezentuje ten tak-przechwytywanie reprezentuje .

5. Kooperatywność odnosi się do interakcji między podjednostkami w wielopodjednostkowym enzymie lub białku. Wiązanie substratu do jednej podjednostki indukuje zmianę w innych podjednostkach ze stanu T (napiętego) do stanu R (rozluźnionego), co sprzyja wiązaniu substratu do innych podjednostek. W odwrotnym kierunku, odłączenie podłoża od jednej podjednostki indukuje zmianę od R do T w pozostałych podjednostkach, sprzyjając odwiązaniu podłoża od pozostałych podjednostek.

1. Wraz ze wzrostem temperatury aktywność enzymów na ogół wzrasta (podwaja się co około 10°C). Jednak powyżej temperatury ciała aktywność enzymów szybko spada, gdy enzym ulega denaturacji.
Enzymy są maksymalnie aktywne w małym zakresie pH poza tym zakresem, aktywność szybko spada wraz ze zmianami pH, ponieważ zmienia się jonizacja miejsca aktywnego i białko jest denaturowane.
Zmiany w zasoleniu mogą rozerwać wiązania w enzymie, powodując rozerwanie struktury trzeciorzędowej i czwartorzędowej, co prowadzi do utraty funkcji enzymu.

2. Idealna temperatura: 37 ° C = 98,6 ° F = 310 K

Idealne pH dla większości enzymów wynosi 7,4 dla enzymów żołądkowych, około 2 dla enzymów trzustkowych, około 8,5.

1. Hamowanie sprzężenia zwrotnego odnosi się do produktu szlaku enzymatycznego, który wyłącza enzymy z powrotem w tej samej ścieżce. Pomaga to utrzymać homeostazę: wraz ze wzrostem poziomu produktu ścieżka tworząca ten produkt jest odpowiednio regulowana w dół.

2. Cztery typy inhibitorów to: konkurencyjny, niekonkurencyjny, mieszany i niekonkurencyjny.

3. Nieodwracalne hamowanie odnosi się do przedłużonej lub trwałej inaktywacji enzymu, tak że nie można go łatwo zregenerować w celu uzyskania funkcji.

4. Przykłady przejściowych modyfikacji obejmują aktywację lub inhibicję allosteryczną. Przykłady modyfikacji kowalencyjnych obejmują fosforylację i glikozylację.

5. Zymogeny są prekursorami aktywnego enzymu. Bardzo ważne jest, aby niektóre enzymy (takie jak enzymy trawienne trzustki) pozostały nieaktywne, dopóki nie dotrą do miejsca docelowego.

Równania do zapamiętania

(2.1) Stawki Michaelisa-Mentena:

(2.2) Równanie Michaelisa-Mentena:

Wspólne koncepcje

&środkowa kropkaBiochemia Rozdział 1

o Aminokwasy, peptydy i białka

&środkowa kropkaBiochemia Rozdział 12

o Bioenergetyka i regulacja metabolizmu

&środkowa kropkaBiologia Rozdział 9

&środkowa kropkaChemia ogólna Rozdział 5

&środkowa kropkaChemia ogólna Rozdział 7

&środkowa kropkaChemia ogólna Rozdział 11

o Reakcje utleniania-redukcji

Jeśli jesteś właścicielem praw autorskich do jakichkolwiek materiałów zawartych w naszej witrynie i zamierzasz je usunąć, skontaktuj się z naszym administratorem witryny w celu uzyskania zgody.


Na wykresie Lineweaver-Burk, dlaczego przecięcie osi x = -1/Km? - Biologia

Którego z nich można się spodziewać, jeśli średnia temperatura na świecie wzrośnie?

Proszę odpowiedzieć na pytanie na obrazku.

Hing wytwarza wiciowce. Odpowiedź 1 Wybierz. składnik ściany komórkowej grzyba Odpowiedź 2 Wybierz. partnerstwo między grzybem a komórkami fotosyntezy Odpowiedź 3 Wybierz. włókno grzybni Odpowiedź 4 Wybierz. grzyb jednokomórkowy Odpowiedź 5 Wybierz. Przykładem jest forma do chleba Odpowiedź 6 Wybierz. powiązanie grzybowo-korzeniowe Odpowiedź 7 Wybierz. wiele form grzybów

Dopasowywanie wytwarza wiciowce. Odpowiedź 1 Wybierz. składnik ściany komórkowej grzyba Odpowiedź 2 Wybierz. partnerstwo między grzybem a komórkami fotosyntezy Odpowiedź 3 Wybierz. włókno grzybni Odpowiedź 4 Wybierz. grzyb jednokomórkowy Odpowiedź 5 Wybierz. Przykładem jest forma do chleba Odpowiedź 6 Wybierz. powiązanie grzybowo-korzeniowe Odpowiedź 7 Wybierz. wiele form grzybów

https://watermarkonline.com/advert/live-man-city-vs-psg-live-stream-uefa-champions-league-semi-final-watch-online-tv-channel/ https://www.ghanaembassy. ru/advert/stream-paris-saint-germain-vs-man-city-live-stream-free-acf/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/ Man%20City%20vs%20Paris%20Saint-Germain%20Live%20Stream.pdf https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/PSG%20vs%20Man%20City%20Live %20Stream.pdf

https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Movie-Online-Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree -psg-vs-man-city-live-stream-uefa-champions-league-semi-finals-2021-watch-online-on-tv/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466 /files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Film-Online-Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree-psg-vs-man-city-stream-stream-uefa-champions- Półfinały-ligi-2021-oglądaj-online-na-telewizji/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Film-Online- Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree-psg-vs-man-city-live-stream-uefa-champions-league-semi-finals-2021-watch-online-on-tv/

Mortal Kombat 2021 obejrzyj teraz cały film: https://putlockershd.org/en/movie/460465/mortal-kombat Umyty zawodnik MMA Cole Young, nieświadomy swojego dziedzictwa, ścigany przez najlepszego wojownika Imperatora Shang Tsung', Sub Zero, wyszukuje i trenuje z największymi mistrzami Ziemi, przygotowując się do stawienia czoła wrogom Outworld w bitwie o wysoką stawkę o wszechświat. Data wydania: 07.04.2021 Czas trwania: 110 minut Gatunek: Fantasy, Akcja, Przygoda, Science fiction, Thriller Gwiazdy: Lewis Tan, Jessica McNamee, Josh Lawson, Tadanobu Asano, Mehcad Brooks Reżyser: James Wan, Benjamin Wallfisch, Dan Lebental, Todd Garner, Naaman Marshall

aktualizacja filmu maj 2021 maj 2021 Filmy: Gniew człowieka • Tutaj dzisiaj • Spirala: Z Księgi Piły • Ciche miejsce Część II • Okruta • Czynnik ludzki • Profil, filmy w maju. Poniżej znajduje się miejsce, w którym znajdziesz wszystkie filmy, na które czekamy w 2021 roku i kiedy się ich spodziewać. Oczywiście, jak już wszyscy powinniśmy być przyzwyczajeni, daty mogą ulec zmianie, więc pamiętaj, aby sprawdzić zmiany w harmonogramie. Cieszyć się! polecana strona: https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=6c2c59de-3648-4063-a034-e8cff4bbdf1f https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=16bb8ec2- a192-43cc-81a2-1ed377c2b649 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=1151c99f-2f95-46a8-bdd8-0410d6862cc3 https://connect.informs.org/network/members/profile? UserKey=912d4929-73b6-4c38-a151-45ed3703bd32 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=210346ea-1569-42c6-a085-bd4484bd0543 https://connect.informs.org/network/ members/profile?UserKey=2b731e2d-6bff-429a-a244-4d4d0f85a618 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=f8ada4d3-cfbb-4551-a00d-4231a50cde4d https://connect.informs. org/network/members/profile?UserKey=822e0277-7aac-4646-849f-fcbf0cd667b6 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e0429956-f03a-4e0d-9c38-94dcc92f476b https:// connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=89fc15a2-63dd-4b3a-bb0a-b362acec59e3 https://conn ect.informs.org/network/members/profile?UserKey=dcf3dcac-9188-4adb-ada9-f0b63c87fa12 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=a4178d4e-3975-4777-a938-b8976bf2c15e https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=6cb9a3e8-1c92-4730-9337-e5a3d4f56b71 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=b4500502-207d-4fcc -82cd-2a5f00b8fddd https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=2fb2227c-62cc-47de-917d-02db5508293d https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e29dc7e2 -c81a-4796-af2a-1e2767bed12a https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e05b2e64-05b2-4c76-94ee-ca4698755a88 https://connect.informs.org/network/members/profile ?UserKey=0ee0e91e-3fc1-4c25-8c27-feafc9f467db https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=a7718e4e-807a-4d90-ad7f-b883c6bfdcd7 https://connect.informs.org/network /members/profile?UserKey=8a292769-6347-41be-b483-eb64919b8ca8 https://volunteer.alz.org/network/members/ profil?UserKey=35cd0e7d-c38f-416c-931a-41224d55f72c https://vrip.unmsm.edu.pe/foro-vrip/profile/hvsdghds/ https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey =23a184ef-8bc7-4ef9-8c1e-73c80d467e65 https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey=96b868c3-999f-4e78-b7eb-6aafc567093d https://community.afpglobal.org/network/members /profile?UserKey=db7ac908-f911-47a4-bd10-ce0a595890fa https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey=7df33d7b-d8b1-46c2-a0bf-29d323c4fd9d https://connect.informs.org /network/members/profile?UserKey=b6baee9e-37a0-455b-9a9f-370f605f777b https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=d891d4b4-ae89-40f1-9664-d40c95594c1a http://paste .jp/9bc0426d/ https://slexy.org/view/s21WvhFTV5 https://pastebin.com/iKX5BN9C https://pasteio.com/xlb9MOCQr7Cr https://paste.in/ei93EI https://jsfiddle.net /berlinm821/ojt20f7u/2/ https://pastelink.net/2ucpm https://paiza.io/projects/hB6o7e_Q6dMCcjYDZcUiww http://www.mpaste.com/p/sAa FRuS https://telegra.ph/movie-update-may-2021-04-27 https://p.ip.fi/M4fO https://penzu.com/p/c67089c1 https://onlinegdb.com/ rJ5Ook8Pu https://justpaste.it/8drs7 https://dpaste.com/CRZMPUWJ4 https://paste.feed-the-beast.com/view/7313cf08 https://paste.ubuntu.com/p/GrYWgDhyxc/ https://paste.firnsy.com/paste/0sMc4O2HcWW https://0paste.com/245320 https://rentry.co/emthk https://friendpaste.com/7Tl1x5y76wYuFsnWDlnA9h https://paste.rs/dPc https ://paste.laravel.io/8981a0c9-c46c-49c5-b1e8-d97b434c8204 https://www.mydigoo.com/forums-topicdetail-266611.html https://authors.curseforge.com/paste/ddbe8302 http: //network-marketing.ning.com/profiles/blogs/movie-update-may-2021 https://www.unphp.net/decode/2e3e95933979537628df815efc68e2cf/ http://paste4btc.com/0nKEicI6 https://paste. artemix.org/-/9taQ4

https://personaljournal.ca/delonse/movie-update-may-2021 https://paste.tbee-clan.de/cqkjf# https://peatix.com/group/10597464 https://read.cash/ @sfsdfsdfdfdf/movie-update-may-2021-21234259 https://www.mychemicalromance.com/news/movie-update-may-2021-3720041 https://newsgfheyy.cookpad-blog.jp/articles/592503 https: //note.com/vffdeefef/n/n9a3be1d3bea6 https://teletype.in/@gfdgfgfdgfd/Jvr-kEozw https://dfeerfsds.sellfy.store/p/movie-update-may-2021/ https://www .furaffinity.net/journal/9856346/ https://lu.ma/28y2kqs9 https://www.tunwalai.com/v2/story/543226?wt=1 Wygląda na to, że Hollywood będzie bardzo zajęty swoim 2021 filmy przychodzące do kin. Z bezbożną ilością komiksów, od Marvela i DC, po nowy film Szybcy i wściekli, następny rok kalendarzowy będzie wypełniony po brzegi najbardziej oczekiwanymi premierami, jakie kiedykolwiek zostaną ogłoszone. Wynika to po części z faktu, że wiele z tych filmów było pierwotnie planowanych do wcześniejszej premiery lub powinno było wyjść kilka miesięcy temu.

https://www.bigmarker.com/watchuefa/Live-PSG-vs-Man-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online-TV https://www.bigmarker.com/watchuefa/PSG-vs -Man-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online-TV https://www.bigmarker.com/watchuefa/PSG-vs-Manchester-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online- Telewizja https://www.bigmarker.com/watchuefa/How-to-Stream-Manchester-City-vs-PSG-Live-Free-Stream-UEFA-Reddit-Online

. Pojedynczy żółty samiec skojarzył się z kilkoma samicami typu dzikiego (aguti). W sumie krycie dało 40 potomstwa, 22 z sierścią agouti i 18 z żółtą sierścią. Myszy agouti F1 krzyżowano ze sobą i dały wszystkie myszy agouti w F2. Podobnie żółte zwierzęta F1 krzyżowano ze sobą, ale ich potomstwo F2 podzieliło się na dwie klasy: 30 to agouti, a 54 to żółte. Jaki jest wzór dziedziczenia koloru sierści u tych myszy? Użyj α2, aby sprawdzić, czy fenotypy w F2 pasują do oczekiwanego stosunku Mendla.


Na wykresie Lineweaver-Burk, dlaczego przecięcie osi x = -1/Km? - Biologia

dr Peter J. Kennelly i dr Victor W. Rodwell

Po przestudiowaniu tego rozdziału powinieneś być w stanie:

Opisać zakres i ogólne cele badania kinetyki enzymów.

Wskaż, czy &Deltag, całkowita zmiana energii swobodnej dla reakcji, zależy od mechanizmu reakcji.

Wskaż, czy &Deltag jest funkcją stawki reakcji.

Wyjaśnij związek między Krówn, stężenia substratów i produktów w równowadze oraz stosunek stałych szybkości k1/k–1.

Nakreśl, jak temperatura i stężenie jonów wodorowych, enzymu i substratu wpływają na szybkość reakcji katalizowanej enzymami.

Wskaż, dlaczego laboratoryjny pomiar szybkości reakcji katalizowanej enzymami zazwyczaj wykorzystuje warunki szybkości początkowej.

Opisz zastosowanie liniowych postaci równania Michaelisa-Mentena do wyznaczania Km oraz Vmaks.

Podaj jeden powód, dla którego liniowa postać równania Hilla jest używana do oceny kinetyki wiązania substratu wykazywanej przez niektóre enzymy multimeryczne.

Porównajcie wpływ rosnącego stężenia substratu na kinetykę prostego hamowania kompetycyjnego i niekompetycyjnego.

Opisz, w jaki sposób substraty dodają się do enzymu działającego zgodnie z mechanizmem ping-pong, a produkty od niego odchodzą, i zrób to samo dla enzymu, który działa zgodnie z mechanizmem szybkiej równowagi.

Zilustruj użyteczność kinetyki enzymów w ustalaniu sposobu działania leków.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE

Kinetyka enzymatyczna jest dziedziną biochemii zajmującą się ilościowym pomiarem szybkości reakcji katalizowanych enzymami i systematycznym badaniem czynników wpływających na te szybkości. Analiza kinetyczna może ujawnić liczbę i kolejność poszczególnych etapów, za pomocą których enzymy przekształcają substraty w produkty. Wraz z ukierunkowaną mutagenezą i innymi technikami badającymi strukturę białka, analizy kinetyczne mogą ujawnić szczegóły mechanizmu katalitycznego danego enzymu.

Kompletny, zrównoważony zestaw aktywności enzymów ma fundamentalne znaczenie dla utrzymania homeostazy. Zrozumienie kinetyki enzymów jest zatem ważne dla zrozumienia, jak stresy fizjologiczne, takie jak niedotlenienie, kwasica metaboliczna lub zasadowica, toksyny i czynniki farmakologiczne wpływają na tę równowagę. Zaangażowanie enzymów w praktycznie wszystkie procesy fizjologiczne sprawia, że ​​są one wybieranymi celami leków, które leczą lub łagodzą choroby u ludzi. Zastosowana kinetyka enzymatyczna stanowi główne narzędzie, za pomocą którego naukowcy identyfikują i charakteryzują środki terapeutyczne, które selektywnie hamują tempo określonych procesów katalizowanych enzymami. Kinetyka enzymatyczna odgrywa zatem centralną i kluczową rolę w odkrywaniu leków i farmakodynamice porównawczej, a także w wyjaśnianiu sposobu działania leków.

REAKCJE CHEMICZNE SĄ OPISANE PRZY UŻYCIU ZRÓWNOWAŻONYCH RÓWNAŃ

A zrównoważone równanie chemiczne wymienia początkowe związki chemiczne (substraty) obecne i nowe związki chemiczne (produkty) utworzone dla konkretnej reakcji chemicznej, wszystkie we właściwych proporcjach lub stechiometria. Na przykład zrównoważone równanie (1) opisuje reakcję jednej cząsteczki każdego z substratów A i B z wytworzeniem jednej cząsteczki każdego z produktów P i Q:

Podwójne strzałki wskazują na odwracalność, nieodłączną właściwość wszystkich reakcji chemicznych. Tak więc dla reakcji (1), jeśli A i B mogą tworzyć P i Q, to P i Q mogą również tworzyć A i B. Oznaczenie konkretnego reagenta jako „podłoża” lub „produktu” jest zatem nieco arbitralne, ponieważ produkty reakcji zapisane w jednym kierunek są substratami reakcji odwrotnej. Termin „produkty” jest jednak często używany do oznaczania reagentów, których tworzenie jest termodynamicznie faworyzowane. Reakcje, dla których czynniki termodynamiczne silnie sprzyjają powstawaniu produktów, na które wskazują strzałki często są przedstawiane pojedynczą strzałką tak, jakby były „nieodwracalne”:

Strzałki jednokierunkowe służą również do opisu reakcji w żywych komórkach, w których produkty reakcji (2) są natychmiast zużywane w kolejnej reakcji katalizowanej enzymami. Szybkie usunięcie produktu P lub Q skutecznie wyklucza zatem wystąpienie reakcji odwrotnej, oddając równanie (2) funkcjonalnie nieodwracalne w warunkach fizjologicznych.

ZMIANY ENERGII WOLNEJ OKREŚLAJĄ KIERUNEK I STAN RÓWNOWAGOWY REAKCJI CHEMICZNYCH

Zmiana energii swobodnej Gibbsa i deltag (nazywana również energią swobodną lub energią Gibbsa) opisuje zarówno kierunek w którym reakcja chemiczna będzie miała tendencję do zachodzenia oraz stężenia reagentów i produktów, które będą obecne w stanie równowagi. &Deltag dla reakcji chemicznej równa się sumie energii swobodnej powstawania produktów reakcji &DeltagP minus suma energii swobodnej tworzenia substratów &Deltags. &Deltag 0 oznacza zmianę energii swobodnej, która towarzyszy przejściu od stanu standardowego, jednomolowych stężeń substratów i produktów, do stanu równowagi. Bardziej użytecznym terminem biochemicznym jest &Deltag 0 ’, który definiuje &Deltag 0 w standardowym stanie 10-7 M protonów, pH 7,0 (Rozdział 11). Jeżeli energia swobodna tworzenia produktów jest niższa niż energia substratów, znaki &DeltaG 0 i &DeltaZ 0’ będzie ujemna, co oznacza, że ​​zapisana reakcja jest preferowana w kierunku od lewej do prawej. Takie reakcje są określane jako spontaniczny. ten znak i ogrom zmiany energii swobodnej określają, jak daleko zajdzie reakcja. Równanie (3) ilustruje zależność między stałą równowagi Krówn i &Deltag 0 :

gdzie r jest stałą gazową (1,98 cal/mol°K lub 8,31 J/mol°K) oraz T to temperatura bezwzględna w stopniach Kelvina. Krówn jest równy iloczynowi stężeń produktów reakcji, z których każdy został podniesiony do potęgi ich stechiometrii, podzielony przez iloczyn substratów, z których każdy został podniesiony do potęgi ich stechiometrii:

Za reakcję

&Deltag 0 można obliczyć z równania (3), jeśli znane są stężenia molowe substratów i produktów obecnych w stanie równowagi. Jeśli &Deltag 0 to liczba ujemna, Krówn będzie większa niż jedność, a stężenie produktów w równowadze przekroczy stężenie substratów. Jeśli &Deltag 0 jest dodatnie, Krówn będzie mniejsza niż jedność, a tworzenie podłoży będzie preferowane.

Zauważ, że od &Deltag 0 jest funkcją wyłącznie stanów początkowych i końcowych reagujących gatunków, może dostarczać informacji tylko o kierunek oraz stan równowagi reakcji. &Deltag 0 jest niezależne od mechanizm reakcji, a zatem nie dostarcza żadnych informacji dotyczących stawki reakcji. W związku z tym&mdashand jak wyjaśniono poniżej&mdashalchociaż reakcja może miećdużą ujemną &Deltag 0 lub &Deltag 0 ”, może jednak odbywać się w znikomym tempie.

SZYBKOŚCI REAKCJI ZDECYDOWANE SĄ ICH ENERGIĄ AKTYWACJI

Reakcje przebiegają przez stany przejściowe

Pojęcie stan przejściowy ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia chemicznej i termodynamicznej podstawy katalizy. Równanie (7) przedstawia reakcję przeniesienia grupy, w której wchodząca grupa E wypiera opuszczającą grupę L, przyłączoną początkowo do R:

Wynikiem netto tego procesu jest przeniesienie grupy R z L do E. W połowie przemieszczenia wiązanie między R i L osłabło, ale nie zostało jeszcze całkowicie zerwane, a nowe wiązanie między E i R jest jeszcze niecałkowicie utworzone. Ten przejściowy produkt pośredni &ndashin, w którym nie istnieje ani wolny substrat, ani produkt&mdashi, określany jest jako stan przejściowy, E···R···L. Linie przerywane reprezentują „częściowe” wiązania, które ulegają tworzeniu i zerwaniu. Rysunek 8–1 dostarcza bardziej szczegółowej ilustracji pośredniego stanu przejściowego utworzonego podczas przenoszenia grupy fosforylowej.

RYSUNEK 8–1 Powstawanie związku pośredniego stanu przejściowego podczas prostej reakcji chemicznej, Pokazane są trzy etapy reakcji chemicznej, w której grupa fosforylowa jest przenoszona z grupy opuszczającej L do grupy wchodzącej E. U góry: grupa wchodząca E (A) zbliża się do drugiego reagenta, L-fosforanu (B). Zwróć uwagę, jak trzy atomy tlenu połączone trójkątnymi liniami i atom fosforu grupy fosforylowej tworzą piramidę. Środek: gdy E zbliża się do L-fosforanu, nowe wiązanie między E a grupą fosforanową zaczyna się tworzyć (linia przerywana), ponieważ osłabia się połączenie L z grupą fosforanową. Te częściowo uformowane wiązania są oznaczone liniami przerywanymi. Na dole: tworzenie nowego produktu, E-fosforanu (P), jest teraz zakończone, gdy opuszcza się grupa L (Q). Zwróć uwagę, jak geometria grupy fosforylowej różni się między stanem przejściowym a substratem lub produktem. Zwróć uwagę, jak fosfor i trzy atomy tlenu, które zajmują cztery rogi piramidy w podłożu i produkcie, stają się współpłaszczyznowe, co podkreśla trójkąt, w stanie przejściowym.

Reakcja (7) można uważać za składającą się z dwóch „reakcji częściowych”, przy czym pierwsza odpowiada powstawaniu (F), a druga kolejnemu rozpadowi (D) związku pośredniego stanu przejściowego. Jak dla wszystkich reakcji, charakterystyczne zmiany energii swobodnej, &DeltagF i &DeltagD są związane z każdą reakcją częściową:

Dla ogólnej reakcji (10), &Deltag jest sumą &DeltagF i &DeltagD. Jeśli chodzi o równanie złożone z dwóch wyrazów, nie można wywnioskować z &Deltag znak lub wielkość &DeltagF lub &DeltagD.

Wiele reakcji obejmuje wiele stanów przejściowych, z których każdy wiąże się ze zmianą energii swobodnej. Dla tych reakcji ogólna &Deltag reprezentuje sumę wszystko zmian energii swobodnej związanych z powstawaniem i rozpadem wszystko stanów przejściowych. Dlatego nie można wywnioskować z całości &Deltag liczba lub rodzaj stanów przejściowych, przez które przebiega reakcja. Innymi słowy, ogólna termodynamika nie mówi nam nic o kinetyce.

&Delta gF Definiuje energię aktywacji

Niezależnie od znaku lub wielkości &DeltaG, &DeltagF bo przytłaczająca większość reakcji chemicznych ma pozytywny znak. Powstawanie półproduktów stanu przejściowego wymaga zatem pokonania barier energetycznych. Z tego powodu &DeltagF za osiągnięcie stanu przejściowego często nazywa się energia aktywacji, midziałać. Łatwość i częstość, z jaką ta bariera jest pokonywana, jest odwrotnie proporcjonalna do midziałać. Parametry termodynamiczne, które określają sposób szybki reakcja zachodzi, więc są &DeltagF wartości dla tworzenia stanów przejściowych, przez które przebiega reakcja. Dla prostej reakcji, gdzie &prop oznacza „proporcjonalnie do”

Energia aktywacji dla reakcji przebiegającej w kierunku przeciwnym do wylosowanej jest równa –&DeltaGD.

LICZNE CZYNNIKI WPŁYWAJĄ NA SZYBKOŚĆ REAKCJI

ten teoria kinetyczna&mdash zwany także teoria kolizjiChemiczna kinetyka &mdashof mówi, że dla dwóch cząsteczek wchodzących w reakcję muszą (1) muszą zbliżać się do siebie na odległość tworzącą wiązanie lub „zderzać się” i (2) musi posiadać wystarczającą energię kinetyczną do pokonania bariery energetycznej dla osiągnięcia stanu przejściowego. Wynika z tego, że wszystko, co zwiększa częstotliwość lub energia kolizji między podłożami zwiększy szybkość reakcji, w której uczestniczą.

Temperatura

Podniesienie temperatury zwiększa energię kinetyczną cząsteczek. Jak pokazano w Rysunek 8–2, całkowita liczba cząsteczek, których energia kinetyczna przekracza barierę energetyczną midziałać (pionowy słupek) do tworzenia produktów wzrasta od niskich (A) przez pośrednie (B) do wysokich (C) temperatur. Zwiększenie energii kinetycznej cząsteczek zwiększa również ich szybkość ruchu, a tym samym częstotliwość, z jaką się zderzają. Ta kombinacja częstszych i bardziej energetycznych, a tym samym produktywnych zderzeń zwiększa szybkość reakcji.

RYSUNEK 8-2 Bariera energetyczna dla reakcji chemicznych. (Zobacz tekst do dyskusji.)

Stężenie reagenta

Częstotliwość, z jaką zderzają się cząsteczki, jest wprost proporcjonalna do ich stężeń. W przypadku dwóch różnych cząsteczek A i B częstotliwość ich zderzeń podwoi się, jeśli stężenie A lub B zostanie podwojone. Jeśli stężenia zarówno A, jak i B zostaną podwojone, prawdopodobieństwo kolizji wzrośnie czterokrotnie.

W przypadku reakcji chemicznej przebiegającej w stałej temperaturze, która obejmuje jedną cząsteczkę z każdej z A i B,

liczba cząsteczek, które posiadają energię kinetyczną wystarczającą do pokonania bariery energii aktywacji będzie stała. Liczba zderzeń o energii wystarczającej do wytworzenia produktu P będzie zatem wprost proporcjonalna do liczby zderzeń między A i B, a tym samym do ich stężeń molowych, oznaczonych nawiasami kwadratowymi:

Podobnie dla reakcji reprezentowanej przez

który można również zapisać jako

Odpowiednie wyrażenie stawki to

W przypadku ogólnym, kiedy n cząsteczki A reagują z m cząsteczki B,

Zastąpienie znaku proporcjonalności znakiem równości przez wprowadzenie a stała szybkość k charakterystyka badanej reakcji podaje równania (20) i (21), w których indeksy 1 i –1 odnoszą się odpowiednio do reakcji w przód i w tył:

Suma stosunków molowych reagentów określa porządek kinetyczny reakcji. Rozważ reakcję (5). Współczynnik stechiometryczny dla jedynego reagenta, A, wynosi 2. Dlatego szybkość produkcji P jest proporcjonalna do kwadratu [A] i mówi się, że reakcja jest drugie zamówienie w odniesieniu do reagenta A. W tym przypadku ogólna reakcja jest również drugie zamówienie. W związku z tym, k1 jest określany jako stała szybkości drugiego rzędu.

Reakcja (12) opisuje prostą reakcję drugiego rzędu między dwoma różnymi reagentami, A i B. Współczynnik stechiometryczny dla każdego reagenta wynosi 1. Dlatego, podczas gdy ogólny porządek reakcji wynosi 2, mówi się, że jest Pierwsze zamówienie w odniesieniu do A i Pierwsze zamówienie w odniesieniu do B. W laboratorium porządek kinetyczny reakcji w odniesieniu do konkretnego reagenta, zwanego zmiennym reagentem lub substratem, można określić, utrzymując stężenie innych reagentów na stałym lub stałym stężeniu w dużym nadmiarze nad zmiennym reagentem. Pod tymi warunki pseudopierwszego rzędu, stężenie utrwalonego(ych) reagenta(ów) pozostaje praktycznie stałe. Zatem szybkość reakcji będzie zależeć wyłącznie od stężenia reagenta zmiennego, czasami zwanego również reagentem ograniczającym. Pojęcia porządku reakcji i warunków pseudopierwszego rzędu dotyczą nie tylko prostych reakcji chemicznych, ale także reakcji katalizowanych enzymami.

Krówn Jest stosunkiem stałych szybkości

Podczas gdy wszystkie reakcje chemiczne są do pewnego stopnia odwracalne, w równowadze ogólnie stężenia reagentów i produktów pozostają stałe. W stanie równowagi szybkość konwersji substratów w produkty jest zatem równa szybkości, z jaką produkty są przekształcane w substraty:

Stosunek k1 do k–1 nazywa się stałą równowagi, Krówn. Należy pamiętać o następujących ważnych właściwościach układu w równowadze.

1. Stała równowagi jest stosunkiem reakcji stałe szybkości (nie reakcja stawki).

2. W równowadze reakcja stawki (nie stałe szybkości) reakcji do przodu i do tyłu są równe.

3. Równowaga to dynamiczny stan. Chociaż nie ma Internet zmiana stężenia substratów lub produktów, poszczególne cząsteczki substratu i produktu są nieustannie przekształcane.

4. Wartość liczbowa stałej równowagi Krówn można obliczyć ze stężeń substratów i produktów w stanie równowagi lub ze stosunku k1/k–1.

KINETYKA KATALIZACJI ENZYMATYCZNEJ

Enzymy obniżają barierę energii aktywacji w celu reakcji

Wszystkie enzymy przyspieszają szybkość reakcji poprzez obniżanie &DeltagF do tworzenia stanów przejściowych. Mogą jednak różnić się sposobem, w jaki jest to osiągane. Jeżeli mechanizm lub sekwencja etapów chemicznych w miejscu aktywnym jest zasadniczo równoważna z tymi dla tej samej reakcji przebiegającej bez katalizatora, obniża się środowisko miejsca aktywnego &DeltagF stabilizując półprodukty stanu przejściowego. Innymi słowy, enzym można wyobrazić sobie jako wiązanie z pośrednim stanem przejściowym (Rysunek 8–1) ściślej niż w przypadku podłoży lub produktów. Jak omówiono w Rozdział 7, stabilizacja może obejmować (1) grupy kwasowo-zasadowe odpowiednio ustawione do przenoszenia protonów do lub z rozwijającego się pośredniego stanu przejściowego, (2) odpowiednio umieszczone naładowane grupy lub jony metali, które stabilizują rozwijające się ładunki, lub (3) nałożenie sterycznego naprężenia na podłoża, tak aby ich geometria była zbliżona do stanu przejściowego. Proteaza HIV (patrz Rysunek 7–6) ilustruje katalizę przez enzym, który obniża barierę aktywacji przez stabilizowanie związku pośredniego w stanie przejściowym.

Kataliza przez enzymy, która przebiega przez a jedyny w swoim rodzaju mechanizm reakcji zwykle występuje, gdy półprodukt stanu przejściowego tworzy wiązanie kowalencyjne z enzymem (kataliza kowalencyjna). Mechanizm katalityczny chy-motrypsyny proteazy serynowej (patrz Rysunek 7–7) ilustruje, w jaki sposób enzym wykorzystuje katalizę kowalencyjną, aby zapewnić unikalny szlak reakcji.

ENZYMY NIE WPŁYWAJĄKrówn

Podczas gdy enzymy ulegają przejściowym modyfikacjom podczas procesu katalizy, zawsze pojawiają się niezmienione po zakończeniu reakcji. Obecność enzymu nie ma zatem wpływu na &Deltag 0 dla ogólniereakcja, który jest funkcją wyłącznie stan początkowy i końcowy reagentów. Równanie (25) pokazuje zależność między stałą równowagi dla reakcji a standardową zmianą energii swobodnej dla tej reakcji:

Ta zasada jest prawdopodobnie najłatwiej zilustrowana przez uwzględnienie obecności enzymu (Enz) w obliczeniach stałej równowagi dla reakcji katalizowanej enzymami:

Ponieważ enzym po obu stronach podwójnych strzałek jest obecny w równej ilości i identycznej formie, wyrażenie na stałą równowagi,

redukuje się do identycznego jak w przypadku reakcji pod nieobecność enzymu:

Enzymy zatem nie mają wpływu na Krówn.

WIELE CZYNNIKÓW WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ ENZYM

Temperatura

Podwyższenie temperatury zwiększa szybkość reakcji zarówno niekatalizowanych, jak i katalizowanych enzymami poprzez zwiększenie energii kinetycznej i częstotliwości zderzeń reagujących cząsteczek. Jednak energia cieplna może również zwiększyć energię kinetyczną enzymu do punktu, który przekracza barierę energetyczną w celu przerwania oddziaływań niekowalencyjnych, które utrzymują jego trójwymiarową strukturę. Następnie łańcuch polipeptydowy zaczyna się rozwijać lub denaturować, z towarzyszącą utratą aktywności katalitycznej. Zakres temperatury, w którym enzym utrzymuje stabilną, katalitycznie kompetentną konformację, zależy od&mdashand zwykle umiarkowanie przekracza&mdash normalną temperaturę komórek, w których się znajduje. Enzymy pochodzące od ludzi generalnie wykazują stabilność w temperaturach do 45–55°C. W przeciwieństwie do tego, enzymy z mikroorganizmów termofilnych, które rezydują w gorących źródłach wulkanicznych lub podmorskich kominach hydrotermalnych, mogą być stabilne w temperaturach do lub nawet powyżej 100°C.

ten współczynnik temperaturowy (Q10) jest współczynnikiem, o który wzrasta szybkość procesu biologicznego przy wzroście temperatury o 10°C. W przypadku temperatur, powyżej których enzymy są stabilne, tempo większości procesów biologicznych zazwyczaj podwaja się przy wzroście temperatury o 10°C . Zmiany tempa reakcji katalizowanych enzymami, które towarzyszą wzrostowi lub spadkowi temperatury ciała, stanowią istotną cechę przeżycia „zimnokrwistych” form życia, takich jak jaszczurki czy ryby, których temperatura ciała jest dyktowana przez środowisko zewnętrzne. Jednak dla ssaków i innych organizmów homeotermicznych zmiany szybkości reakcji enzymatycznej z temperaturą mają znaczenie fizjologiczne tylko w warunkach takich jak gorączka lub hipotermia.

Stężenie jonów wodorowych

Szybkość prawie wszystkich reakcji katalizowanych enzymami wykazuje istotną zależność od stężenia jonów wodorowych. Większość enzymów wewnątrzkomórkowych wykazuje optymalną aktywność przy wartościach pH od 5 do 9. Zależność aktywności od stężenia jonów wodorowych (Rysunek 8–3) odzwierciedla równowagę między denaturacją enzymu przy wysokim lub niskim pH a wpływem na naładowany stan enzymu, substraty lub oba. W przypadku enzymów, których mechanizm obejmuje katalizę kwasowo-zasadową, zaangażowane reszty muszą być w odpowiednim stanie protonowania, aby reakcja mogła przebiegać. Wiązanie i rozpoznawanie cząsteczek substratu z grupami dysocjowalnymi również zazwyczaj obejmuje tworzenie mostków solnych z enzymem. Najczęściej naładowanymi grupami są grupy karboksylanowe (ujemne) i protonowane aminy (dodatnie). Zysk lub utrata krytycznie naładowanych grup niekorzystnie wpływa na wiązanie substratu, a zatem opóźni lub zniesie katalizę.

RYCINA 8-3 Wpływ pH na aktywność enzymów. Rozważmy na przykład ujemnie naładowany enzym (E – ), który wiąże dodatnio naładowany substrat (SH+). Pokazano proporcję (%) SH+ [] i E – [///] jako funkcję pH. Tylko w obszarze zakreskowanym zarówno enzym, jak i substrat mają odpowiedni ładunek.

BADANIA REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ ENZYMATYCZNIE MIERZĄ PRĘDKOŚĆ POCZĄTKOWĄ

Większość pomiarów szybkości reakcji katalizowanych enzymami wykorzystuje stosunkowo krótkie okresy czasu, warunki, które są zbliżone warunki stawki początkowej. W tych warunkach gromadzą się tylko śladowe ilości produktu, co sprawia, że ​​szybkość reakcji odwrotnej jest nieistotna. ten prędkość początkowa (vi) reakcji jest zatem zasadniczo szybkością reakcji do przodu. W testach aktywności enzymu prawie zawsze stosuje się duży (10 3 –10 7 ) nadmiar molowy substratu w stosunku do enzymu. Pod tymi warunkami, w 1 . jest proporcjonalna do stężenia enzymu. Pomiar początkowej prędkości pozwala zatem oszacować ilość enzymu obecnego w próbce biologicznej.

STĘŻENIE PODŁOŻA WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI

W dalszej części reakcje enzymatyczne są traktowane tak, jakby miały tylko jeden substrat i jeden produkt. W przypadku enzymów z wieloma substratami zasady omówione poniżej mają zastosowanie z równą zasadnością. Co więcej, stosując warunki pseudopierwszego rzędu (patrz wyżej), naukowcy mogą badać zależność szybkości reakcji od konkretnego reagenta poprzez odpowiedni dobór substratów stałych i zmiennych. Innymi słowy, w warunkach pseudo-pierwszego rzędu zachowanie enzymu wielosubstratowego będzie naśladować ten mający pojedynczy substrat. W tym przypadku jednak obserwowana stała szybkości będzie funkcją stałej szybkości k1 dla reakcji, jak również stężenie utrwalonego(ych) substratu(ów).

Dla typowego enzymu, wraz ze wzrostem stężenia substratu, vi. wzrasta aż do osiągnięcia maksymalnej wartości Vmaks (Rysunek 8–4). Gdy dalsze wzrosty stężenia substratu nie rosną dalej vimówi się, że enzym jest „nasycony” substratem. Zauważ, że kształt krzywej, która odnosi aktywność do stężenia substratu (Rysunek 8–4) jest hiperboliczny. W dowolnym momencie tylko cząsteczki substratu, które są połączone z enzymem jako kompleks enzym-substrat (ES), mogą zostać przekształcone w produkt. Ponieważ stała równowagi tworzenia kompleksu enzym-substrat nie jest nieskończenie duża, tylko część enzymu może być obecna jako kompleks ES, nawet gdy substrat występuje w nadmiarze (punkty A i B Rysunek 8-5). W punktach A lub B, zwiększenie lub zmniejszenie [S] spowoduje zatem zwiększenie lub zmniejszenie liczby kompleksów ES z odpowiednią zmianą w vi. W punkcie C (Rysunek 8-5), jednak zasadniczo cały enzym jest obecny jako kompleks ES. Ponieważ żaden wolny enzym nie pozostaje dostępny do tworzenia ES, dalsze wzrosty [S] nie mogą zwiększyć szybkości reakcji. W tych warunkach nasycenia vi. zależy wyłącznie od &mdash, dlatego jest ograniczony przez &mdashszybkość, z jaką produkt dysocjuje od enzymu, dzięki czemu może łączyć się z większą ilością substratu.

RYCINA 8-4 Wpływ stężenia substratu na początkową prędkość reakcji katalizowanej enzymatycznie.

RYCINA 8-5 Reprezentacja enzymu w obecności substratu o stężeniu poniżej Km (A), w stężeniu równym Km (B) i w stężeniu znacznie powyżej Km(C). Punkty A, B i C odpowiadają tym punktom w Rysunek 8–4.

MODEL RÓWNAŃ MICHAELISA–MENTENA i HILLA WPŁYW STĘŻENIA PODŁOŻA

Równanie Michaelisa-Mentena

Równanie Michaelisa-Mentena (29) ilustruje matematycznie zależność między początkową prędkością reakcji vi i stężenie substratu [S], pokazane graficznie w Rysunek 8–4:

Stała Michaelisa Km to stężenie substratu, przy którym vi to połowa maksymalnej prędkości (Vmaks/2) osiągalny przy określonym stężeniu enzymu. Km ma więc wymiary koncentracji substratu. Zależność początkowej prędkości reakcji od [S] i Km można zilustrować, oceniając równanie Michaelisa-Mentena w trzech warunkach.

1. Gdy [S] jest znacznie mniejsze niż Km (punkt A w Rysunki 8-4 oraz 8-5), termin Km + [S] jest zasadniczo równe Km. Wymiana Km + [S] z Km redukuje równanie (29) do

gdzie ≈ oznacza „w przybliżeniu równe”. Odkąd Vmaks oraz Km obie są stałymi, ich stosunek jest stały. Innymi słowy, gdy [S] jest znacznie poniżej Km, vi jest proporcjonalna do k[S]. Początkowa prędkość reakcji jest zatem wprost proporcjonalna do [S].

2. Gdy [S] jest znacznie większe niż Km (punkt C w Rysunki 8–4 oraz 8–5), termin Km + [S] jest zasadniczo równe [S]. Wymiana Km + [S] z [S] zmniejsza równanie (29) do

Tak więc, gdy [S] znacznie przekracza Km, prędkość reakcji jest maksymalna (Vmaks) i nie ma na nie wpływu dalszy wzrost stężenia substratu.

3. Kiedy (punkt B w Rysunki 8–4 oraz 8–5):

Równanie (32) stwierdza, że ​​gdy [S] równa się Km, prędkość początkowa jest w połowie maksymalna. Równanie (32) również ujawnia, że Km Wartość tę można określić doświadczalnie na podstawie stężenia substratu, przy którym prędkość początkowa jest w połowie maksymalna.

Forma liniowa równania Michaelisa-Mentena służy do określenia Km & Vmaks

Bezpośredni pomiar wartości liczbowej Vmaks, a zatem obliczenie Km, często wymaga niepraktycznie wysokich stężeń substratu, aby osiągnąć warunki nasycenia. Liniowa forma równania Michaelisa-Mentena omija tę trudność i pozwala Vmaks oraz Km ekstrapolować na podstawie danych dotyczących prędkości początkowej uzyskanych przy stężeniach substratu niższych niż nasycenie. Zacznij od równania (29),

Równanie (35) jest równaniem linii prostej, , gdzie oraz . Działka 1/vi. jak tak jako funkcja 1/[S] as x dlatego daje prostą linię, której tak punkt przecięcia to 1/Vmaks i którego nachylenie jest Km/Vmaks. Taka fabuła nazywa się a podwójna wzajemność lub Działka tkacza-Burka (Rysunek 8–6). Ustawienie tak wyraz równania (36) równa się zero i rozwiązując przez x ujawnia, że x punkt przecięcia to –1/Km:

RYCINA 8-6 Podwójna odwrotność lub Lineweaver-Burk wykres 1/v1 w porównaniu do 1/[S] użytego do oceny Km oraz Vmaks.

Km jest więc najłatwiej obliczony na podstawie negacji x przechwycić.

Największą zaletą wykresu Lineweavera-Burka jest łatwość, dzięki której można go wykorzystać do określenia mechanizmów kinetycznych inhibitorów enzymów (patrz poniżej). Jednak przy użyciu wykresu podwójnej odwrotności do wyznaczania stałych kinetycznych ważne jest, aby uniknąć wprowadzenia błędu systematycznego poprzez grupowanie danych przy niskich wartościach 1/[S]. Aby uniknąć tego błędu, przygotuj roztwór substratu, którego rozcieńczenie w teście da maksymalne pożądane stężenie substratu. Teraz użyj tej samej objętości roztworów przygotowanych przez rozcieńczenie roztworu podstawowego przez współczynniki 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 itd. Następnie dane będą spadać na oś 1/[S] w odstępach 1, 2, 3, 4, 5 itd. Alternatywnie, pojedynczy wykres odwrotny, taki jak Eadie-Hofstee (vi przeciw vi/[S]) lub Hanes–Wolf ([S]/vi w zależności od [S]) wykresu można użyć do zminimalizowania grupowania.

Stała katalityczna, kKot

Do porównania względnej aktywności różnych enzymów lub różnych preparatów tego samego enzymu można zastosować kilka parametrów. Aktywność zanieczyszczonych preparatów enzymatycznych zazwyczaj wyraża się jako konkretna czynność (Vmakspodzielone przez stężenie białka). Dla enzymu jednorodnego można obliczyć jego numer obrotu (Vmaks podzielone przez mole obecnego enzymu). Ale jeśli znana jest liczba obecnych miejsc aktywnych, aktywność katalityczna homogenicznego enzymu jest najlepiej wyrażona jako jego stała katalityczna, kKot (Vmaks podzielone przez liczbę aktywnych witryn, ST):

Ponieważ jednostki koncentracji znoszą się, jednostki kKot są wzajemnym czasem.

Jaką miarą należy określić i porównać wydajność różnych enzymów, różnych substratów dla danego enzymu oraz wydajność, z jaką enzym katalizuje reakcję w kierunku do przodu i do tyłu? Chociaż maksymalna zdolność danego enzymu do przekształcania substratu w produkt jest ważna, korzyści płynące z wysokiej kKot można zrealizować tylko wtedy, gdy Km jest wystarczająco niski. Zatem, wydajność katalityczna enzymów najlepiej wyraża stosunek tych dwóch stałych kinetycznych, kKot/Km.

W przypadku niektórych enzymów, gdy substrat zwiąże się z miejscem aktywnym, jest przekształcany w produkt i uwalniany tak szybko, że zdarzenia te są efektywnie natychmiastowe. W przypadku tych wyjątkowo wydajnych katalizatorów etapem ograniczającym szybkość katalizy jest tworzenie kompleksu ES. Mówi się, że takie enzymy są ograniczona dyfuzją, lub katalitycznie doskonały, ponieważ najszybsza możliwa szybkość katalizy jest określona przez szybkość, z jaką cząsteczki poruszają się lub dyfundują przez roztwór. Przykłady enzymów, dla których kKot/Km zbliżają się do granicy dyfuzji 10 8 –10 9 M –1 s –1 obejmują izomerazę triozofosforanową, anhydrazę węglanową, acetylocholinoesterazę i deaminazę adenozynową.

W żywych komórkach zespół enzymów katalizujących kolejne reakcje w kompleksy multimeryczne może ominąć ograniczenia narzucone przez dyfuzję. Geometryczne zależności enzymów w tych kompleksach są takie, że substraty i produkty nie dyfundują do roztworu, aż do zakończenia ostatniego etapu w sekwencji etapów katalitycznych. Syntetaza kwasów tłuszczowych rozszerza tę koncepcję o krok dalej poprzez kowalencyjne przyłączenie rosnącego łańcucha kwasu tłuszczowego substratu do uwięzi biotyny, która obraca się z miejsca aktywnego do miejsca aktywnego w kompleksie, aż do zakończenia syntezy cząsteczki kwasu palmitynowego (Rozdział 23).

Km Może przybliżyć stałą wiązania

Powinowactwo enzymu do jego substratu jest odwrotnością stałej dysocjacji KD do dysocjacji kompleksu enzym-substrat ES:

Innymi słowy, mniejszy tendencja enzymu i jego substratu do dysocjować, ten większy powinowactwo enzymu do jego substratu. Podczas gdy stała Michaelis Km często przybliża stałą dysocjacji KD, nie zawsze tak jest. Dla typowej reakcji katalizowanej enzymami:

Wartość [S], która daje jest

Kiedy , następnie

Stąd 1/Km tylko w przybliżeniu 1/KD w warunkach, w których asocjacja i dysocjacja kompleksu ES przebiegają szybko w stosunku do katalizy. Dla wielu reakcji katalizowanych enzymami, dla których k–1 + k2 jest nie w przybliżeniu równa k–1, 1/Km nie doceni 1 /KD.

Równanie Hilla opisuje zachowanie enzymów, które wykazują kooperatywne wiązanie substratu

Podczas gdy większość enzymów wykazuje prostotę kinetyka nasycenia przedstawiony w Rysunek 8–4 i są odpowiednio opisane przez ekspresję Michaelisa-Mentena, niektóre enzymy wiążą swoje substraty w a spółdzielnia moda analogiczna do wiązania tlenu przez hemoglobinę (Rozdział 6). Kooperacja jest wyłączną właściwością enzymów multimerycznych, które wiążą substrat w wielu miejscach.

W przypadku enzymów wykazujących pozytywną kooperację w wiązaniu substratu kształt krzywej, która odnosi się do zmian vi do zmian w [S] jest sigmoidalny (Rysunek 8–7). Ani ekspresja Michaelisa-Mentena, ani wyprowadzone z niej wykresy nie mogą być wykorzystywane do oceny kinetyki kooperacyjnej. Enzymolodzy stosują zatem graficzną reprezentację Równanie wzgórza pierwotnie wyprowadzony w celu opisania kooperacyjnego wiązania O2 przez hemoglobinę. Równanie (44) reprezentuje równanie Hilla ułożone w formie, która przewiduje linię prostą, gdzie k’ jest stałą zespoloną:

RYCINA 8-7 Przedstawienie kinetyki sigmoidalnej saturacji substratu.

Równanie (44) stwierdza, że ​​gdy [S] jest niskie w stosunku do k’, początkowa prędkość reakcji wzrasta, gdy npotęga [S].

Wykres log vi/(Vmaksvi) versus log[S] daje prostą (Rysunek 8–8), gdzie nachylenie linii n jest Współczynnik wzgórza, parametr empiryczny, którego wartość jest funkcją liczby, rodzaju i siły oddziaływań wielu miejsc wiązania substratu na enzymie. Kiedy , wszystkie miejsca wiązania zachowują się niezależnie i obserwuje się proste zachowanie kinetyczne Michaelisa-Mentena. Gdyby n jest większy niż 1, mówi się, że enzym wykazuje pozytywną kooperację. Wiązanie substratu z jednym miejscem zwiększa następnie powinowactwo pozostałych miejsc do wiązania dodatkowego substratu. Im większa wartość dla n, im wyższy stopień spółdzielczości i tym bardziej sigmoidalna będzie działka vi. w porównaniu z [S]. Prostopadła spadła z punktu, w którym tak dziennik terminów vi/(Vmaksvi) to zero przecina x-oś przy stężeniu substratu określana jako S50, stężenie substratu, które powoduje połowę maksymalnej prędkości. S50 zatem jest analogiczny do P50 do wiązania tlenu z hemoglobiną (Rozdział 6).

RYSUNEK 8-8 Graficzna reprezentacja liniowej postaci równania Hilla służy do oceny S50, stężenie substratu, które daje połowę maksymalnej prędkości, oraz stopień kooperatywności n.

ANALIZA KINETYCZNA ODRÓŻNIA KONKURENCYJNE OD NIEKONKURENCYJNEGO HAMOWANIA

Inhibitory aktywności katalitycznej enzymów dostarczają zarówno środków farmakologicznych, jak i narzędzi badawczych do badania mechanizmu działania enzymów. Siła oddziaływania między inhibitorem a enzymem zależy od sił ważnych w strukturze białka i wiązania ligandu (wiązań wodorowych, oddziaływań elektrostatycznych, oddziaływań hydrofobowych i sił van der Waalsa patrz Rozdział 5). Inhibitory można klasyfikować na podstawie ich miejsca działania na enzym, tego, czy chemicznie modyfikują enzym lub na podstawie parametrów kinetycznych, na które wpływają. Związki, które naśladują stan przejściowy reakcji katalizowanej przez enzym (analogi stanu przejściowego) lub które wykorzystują mechanizm katalityczny enzymu (inhibitory oparte na mechanizmie) mogą być szczególnie silnymi inhibitorami. Kinetycznie rozróżniamy dwie klasy inhibitorów w oparciu o to, czy zwiększenie stężenia substratu przezwycięża hamowanie, czy nie.

Inhibitory konkurencyjne zazwyczaj przypominają substraty

Efekty konkurencyjnych inhibitorów można przezwyciężyć poprzez zwiększenie stężenia substratu. Najczęściej w hamowaniu kompetycyjnym inhibitor (I) wiąże się z częścią miejsca aktywnego wiążącą podłoże, blokując w ten sposób dostęp podłoża. Struktury większości klasycznych konkurencyjnych inhibitorów mają zatem tendencję do przypominania struktur substratu, a zatem są określane jako analogi substratów. Hamowanie enzymu dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian ilustruje kompetycyjne hamowanie przez analog substratu. Dehydrogenaza bursztynianowa katalizuje usunięcie jednego atomu wodoru z każdego z dwumetylenowych węgli bursztynianu (Rysunek 8–9). Zarówno bursztynian, jak i jego strukturalny analog malonian ( – OOC&mdashCH2&mdashCOO – ) może wiązać się z miejscem aktywnym dehydrogenazy bursztynianowej, tworząc odpowiednio kompleks ES lub EI. Ponieważ jednak malonian zawiera tylko jeden węgiel metylenowy, nie może ulegać odwodornieniu.

RYCINA 8-9 Reakcja dehydrogenazy bursztynianowej.

Tworzenie i dysocjacja kompleksu EI to dynamiczny proces opisany przez:

dla której stała równowagi Ki jest

W efekcie, konkurencyjny inhibitor działa poprzez zmniejszenie liczby wolnych cząsteczek enzymu dostępnych do wiązania substratu, tj. do tworzenia ES, a tym samym ostatecznie do tworzenia produktu, Jak opisano poniżej.

Konkurencyjny inhibitor i substrat wywierają wzajemny wpływ na stężenie kompleksów EI i ES. Ponieważ tworzenie kompleksów ES usuwa wolny enzym dostępny do połączenia z inhibitorem, zwiększenie [S] zmniejsza stężenie kompleksu EI i zwiększa szybkość reakcji. Stopień, w jakim [S] musi zostać zwiększony, aby całkowicie przezwyciężyć hamowanie, zależy od stężenia obecnego inhibitora, jego powinowactwa do enzymu, Ki, a powinowactwo, Kmenzymu dla jego substratu.

Podwójnie odwrotne wykresy ułatwiają ocenę inhibitorów

Wykresy z podwójną odwrotnością rozróżniają inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne i upraszczają ocenę stałych hamowania. vi oznacza się przy kilku stężeniach substratu zarówno w obecności, jak i pod nieobecność inhibitora. W przypadku klasycznego hamowania kompetycyjnego linie łączące eksperymentalne punkty danych zbiegają się na osi y (Rysunek 8-10). Ponieważ tak punkt przecięcia jest równy 1/Vmaks, ten wzór wskazuje, że gdy 1/[S] zbliża się do 0, vijest niezależny od obecności inhibitora. Należy jednak pamiętać, że przechwycenie na x-oś różni się w zależności od inhibitor koncentracja&mdashand że od –1/Km jest mniejszy niż 1/Km, Km („pozorny Km”) staje się większy w obecności rosnących stężeń inhibitora. Zatem, konkurencyjny inhibitor nie ma wpływu na Vmaks ale podnosi Km, pozorne Km na podłoże. Dla prostego konkurencyjnego hamowania, przecięcie na x-oś to

RYCINA 8-10 Wykres Lineweavera-Burka przedstawiający proste kompetycyjne hamowanie. Zwróć uwagę na całkowite złagodzenie inhibicji przy wysokim [S] (tj. niskim 1/[S]).

Pewnego razu Km została oznaczona przy braku inhibitora, Ki można obliczyć z równania (47). Ki wartości są używane do porównania różnych inhibitorów tego samego enzymu. Im niższa wartość dla Ki, tym skuteczniejszy inhibitor. Na przykład statyny, które działają jako konkurencyjne inhibitory reduktazy HMG-CoA (Rozdział 26) mieć Ki wartości o kilka rzędów wielkości niższe niż Km do podłoża HMG-CoA.

Proste niekonkurencyjne inhibitory niższe Vmaks Ale nie wpływaj Km

W ścisłej niekonkurencyjnej inhibicji wiązanie inhibitora nie wpływa na wiązanie substratu. Możliwe jest zatem tworzenie zarówno kompleksów EI, jak i EIS. Jednak podczas gdy kompleks enzym-inhibitor może nadal wiązać substrat, jego skuteczność w przekształcaniu substratu w produkt odzwierciedla Vmaks, jest zmniejszona. Inhibitory niekonkurencyjne wiążą enzymy w miejscach odmiennych od miejsca wiązania substratu i generalnie wykazują niewielkie lub żadne podobieństwo strukturalne do substratu.

W przypadku prostego niekonkurencyjnego hamowania, E i EI mają identyczne powinowactwo do substratu, a kompleks EIS generuje produkt w znikomym tempie (Rysunek 8-11). Bardziej złożone niekonkurencyjne hamowanie występuje podczas wiązania inhibitora czy wpływają na pozorne powinowactwo enzymu do substratu, powodując przecięcie linii w trzeciej lub czwartej ćwiartce wykresu o podwójnej odwrotności (nie pokazano). Chociaż niektóre inhibitory wykazują cechy mieszaniny hamowania kompetycyjnego i niekompetycyjnego, ocena tych inhibitorów wykracza poza zakres tego rozdziału.

RYCINA 8-11 Wykres Lineweavera-Burka dla prostego niekonkurencyjnego hamowania.

Wykres Dixona jest czasami stosowany jako alternatywa dla wykresu Lineweavera-Burka do określania stałych hamowania. Prędkość początkowa (vi) mierzy się przy kilku stężeniach inhibitora, ale przy stałym stężeniu substratu (S). Dla prostego konkurencyjnego lub niekonkurencyjnego inhibitora wykres 1/vi w porównaniu ze stężeniem inhibitora [I] daje linię prostą. Doświadczenie powtarza się przy różnych stałych stężeniach podłoża. Wynikowy zestaw linii przecina się na lewo od tak-oś. Do konkurencyjny zahamowanie, prostopadła spadła do x-oś od punktu przecięcia linii daje –Ki (Rysunek 8-12, szczyt). Do niekonkurencyjny hamowanie przechwycenia na x-oś to –Ki (Rysunek 8-12, na dole). Publikacje farmaceutyczne często wykorzystują wykresy Dixona do zilustrowania porównawczej siły konkurencyjnych inhibitorów.

RYCINA 8-12 Zastosowania wykresów Dixona. U góry: hamowanie konkurencyjne, szacowanie Ki. Dół: hamowanie niekonkurencyjne, szacowanie Ki.

Mniej rygorystyczna alternatywa dla Ki miarą siły hamowania jest stężenie inhibitora, które powoduje 50% zahamowanie, IC50. W przeciwieństwie do równowagi stałej dysocjacji Ki, wartość liczbowa IC50 zmienia się w zależności od konkretnych okoliczności stężenia substratu itp., w których jest określany.

Ściśle związane inhibitory

Niektóre inhibitory wiążą się z enzymami z tak dużym powinowactwem, M, że stężenie inhibitora wymagane do pomiaru Ki spada poniżej stężenia enzymu typowo obecnego w teście. W tych okolicznościach znaczna część całkowitego inhibitora może być obecna jako kompleks EI. Jeśli tak, narusza to założenie, ukryte w klasycznej kinetyce stanu stacjonarnego, że stężenie wolnego inhibitora jest niezależne od stężenia enzymu. Analiza kinetyczna tych ściśle związanych inhibitorów wymaga specjalistycznych równań kinetycznych, które uwzględniają stężenie enzymu w celu oszacowania Ki lub IC50 oraz odróżnienie kompetycyjnych od niekonkurencyjnych ściśle związanych inhibitorów.

Nieodwracalne inhibitory „Zatrute” enzymy

W powyższych przykładach inhibitory tworzą dysocjujący, dynamiczny kompleks z enzymem. W pełni aktywny enzym można zatem odzyskać po prostu przez usunięcie inhibitora z otaczającego środowiska. Jednak wiele innych inhibitorów działa nieodwracalnie poprzez chemiczną modyfikację enzymu. Modyfikacje te na ogół obejmują tworzenie lub zrywanie wiązań kowalencyjnych z resztami aminoacylowymi niezbędnymi do wiązania substratu, katalizy lub utrzymania konformacji funkcjonalnej enzymu. Ponieważ te zmiany kowalencyjne są względnie stabilne, enzym, który został „zatruty” nieodwracalnym inhibitorem, takim jak atom metalu ciężkiego lub odczynnik acylujący, pozostaje zahamowany nawet po usunięciu pozostałego inhibitora z otaczającego środowiska.

Hamowanie oparte na mechanizmie

Inhibitory „oparte na mechanizmie” lub „samobójcze” to wyspecjalizowane analogi substratów, które zawierają grupę chemiczną, która może zostać przekształcona przez maszynerię katalityczną docelowego enzymu. Po związaniu z miejscem aktywnym kataliza przez enzym generuje wysoce reaktywną grupę, która tworzy wiązanie kowalencyjne z i blokuje funkcję katalitycznie niezbędnej pozostałości. Specyficzność i trwałość inhibitorów samobójstw, które są zarówno swoiste dla enzymu, jak i niereaktywne poza granicami miejsca aktywnego enzymu, czyni je obiecującymi sposobami do opracowania leków swoistych dla enzymów. Analiza kinetyczna inhibitorów samobójstw wykracza poza zakres tego rozdziału. Ani podejście Lineweaver-Burk, ani Dixon nie mają zastosowania, ponieważ inhibitory samobójstw naruszają kluczowy warunek graniczny wspólny dla obu podejść, a mianowicie, że aktywność enzymu nie zmniejsza się w trakcie testu.

WIĘKSZOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANYCH ENZYMAMI ZAWIERA DWA LUB WIĘCEJ SUBSTRATÓW

Podczas gdy kilka enzymów ma jeden substrat, wiele innych ma dwa i czasem więcej substratów i produktów. Omówione powyżej podstawowe zasady, chociaż zilustrowane dla enzymów jednosubstratowych, mają również zastosowanie do enzymów wielosubstratowych. Wyrażenia matematyczne używane do oceny reakcji wielosubstratowych są jednak złożone. Chociaż szczegółowa analiza pełnego zakresu reakcji wielosubstratowych wykracza poza zakres tego rozdziału, poniżej omówiono niektóre typowe typy zachowań kinetycznych dla reakcji dwusubstratowych i dwuproduktowych (określane jako reakcje „BiBi”).

Reakcje sekwencyjne lub jednoprzemieszczeniowe

w sekwencyjne reakcje, oba substraty muszą połączyć się z enzymem, tworząc trójskładnikowy kompleks, zanim będzie mogła przebiegać kataliza (Rysunek 8–13, szczyt). Reakcje sekwencyjne są czasami określane jako reakcje pojedynczego przemieszczenia, ponieważ grupa podlegająca przeniesieniu jest zwykle przekazywana bezpośrednio, w jednym etapie, z jednego substratu do drugiego. Sekwencyjne reakcje Bi-Bi można dalej rozróżnić na podstawie tego, czy dwa substraty dodają a losowy lub w obowiązkowy zamówienie. W przypadku reakcji losowego rzędu substrat A lub substrat B może najpierw połączyć się z enzymem, tworząc kompleks EA lub EB (Rysunek 8–13, środek). W przypadku reakcji porządku obowiązkowego A musi najpierw połączyć się z E, zanim B będzie mógł połączyć się z kompleksem EA. Jedno wyjaśnienie, dlaczego niektóre enzymy stosują mechanizmy obowiązkowego porządku, można znaleźć w hipotezie indukowanego dopasowania Koshlanda: dodanie A indukuje zmianę konformacyjną w enzymie, który wyrównuje reszty, które rozpoznają i wiążą B.

RYSUNEK 8-13 Reprezentacje trzech klas mechanizmów reakcji Bi–Bi. Poziome linie reprezentują enzym. Strzałki wskazują dodanie substratów i odejście produktów. U góry: uporządkowana reakcja Bi–Bi, charakterystyczna dla wielu oksydoreduktaz zależnych od NAD(P)H. Środek: losowa reakcja Bi–Bi, charakterystyczna dla wielu kinaz i niektórych dehydrogenaz. Dół: reakcja ping-ponga, charakterystyczna dla aminotransferaz i proteaz serynowych.

Reakcje na ping-ponga

Termin "tenis stołowy" dotyczy mechanizmów, w których jeden lub więcej produktów jest uwalnianych z enzymu przed dodaniem wszystkich substratów. Reakcje ping-ponga obejmują katalizę kowalencyjną i przejściową, zmodyfikowaną formę enzymu (patrz Rysunek 7–4). Reakcje ping-pong Bi-Bi są często określane jako reakcje podwójnego przemieszczenia. Grupa ulegająca przeniesieniu jest najpierw wypierana z substratu A przez enzym, tworząc produkt P i zmodyfikowaną formę enzymu (F). Kolejne przeniesienie grupy z F na drugie podłoże B, tworząc produkt Q i regenerując E, stanowi drugie przemieszczenie (Rysunek 8–13, na dole).

Większość reakcji Bi-Bi jest zgodna z kinetyką Michaelisa-Menten

Większość reakcji Bi-Bi odpowiada nieco bardziej złożonej postaci kinetyki Michaelisa-Mentena, w której Vmaks odnosi się do szybkości reakcji osiąganej, gdy oba substraty są obecne na poziomach nasycenia. Każde podłoże ma swoją własną charakterystykę Km wartość, która odpowiada stężeniu, które daje połowę maksymalnej prędkości, gdy drugi substrat jest obecny na poziomach nasycenia. Podobnie jak w przypadku reakcji na jednym podłożu, wykresy podwójnej odwrotności można wykorzystać do określenia Vmaks oraz Km. vi mierzy się jako funkcję stężenia jednego substratu (substratu zmiennego), podczas gdy stężenie drugiego substratu (substrat stały) jest utrzymywane na stałym poziomie. Jeśli linie otrzymane dla kilku stężeń stałych substratów wykreślone są na tym samym wykresie, można wyróżnić mechanizm ping-pong, który daje równoległe linie (Rysunek 8–14), z sekwencyjnego mechanizmu, który daje wzór przecinających się linii (nie pokazano).

RYCINA 8-14 Wykres Lineweaver-Burk dla dwusubstratowej reakcji ping-pongowej. Wzrost stężenia jednego substratu (S1), podczas gdy drugiego podłoża (S2) jest utrzymywana na stałym poziomie dla zmian zarówno x oraz takprzecięcia, ale nie nachylenie.

Badania hamowania produktu służą do uzupełnienia analiz kinetycznych oraz do rozróżnienia uporządkowanych i losowych reakcji Bi-Bi. Na przykład w reakcji Bi-Bi o losowym porządku każdy produkt będzie działał jako konkurencyjny inhibitor przy braku jego produktów ubocznych, niezależnie od tego, który substrat jest oznaczony jako substrat zmienny. Jednak dla mechanizmu sekwencyjnego (Rysunek 8–13, u góry), tylko produkt Q da wzór wskazujący na konkurencyjne hamowanie, gdy A jest substratem zmiennym, podczas gdy tylko produkt P da ten wzór z B jako substratem zmiennym. Inne kombinacje inhibitora produktu i zmiennego substratu wytworzą formy złożonego niekonkurencyjnego hamowania.

WIEDZA NA TEMAT KINETYKI, MECHANIZMU I HAMUJĄCYCH ENZYMÓW W ROZWOJU LEKÓW

Wiele leków działa jako inhibitory enzymów

Celem farmakologii jest identyfikacja środków, które mogą:

1. Zniszczyć lub osłabić wzrost, inwazyjność lub rozwój atakujących patogenów.

2. Stymuluj endogenne mechanizmy obronne.

3. Zatrzymują lub utrudniają nieprawidłowe procesy molekularne wywołane bodźcami genetycznymi, środowiskowymi lub biologicznymi przy minimalnym zaburzeniu normalnych funkcji komórkowych gospodarza.

Ze względu na ich różnorodne role fizjologiczne i wysoki stopień selektywności substratowej, enzymy stanowią naturalne cele dla rozwoju środków farmakologicznych, które są zarówno silne, jak i specyficzne. Leki statynowe, na przykład, obniżają produkcję cholesterolu poprzez hamowanie reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylokoenzymu A (Rozdział 26), podczas gdy emtrycytabina i fumaran dizoproksylu tenofowiru blokują replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności poprzez hamowanie wirusowej odwrotnej transkryptazy (Rozdział 34). Farmakologiczne leczenie nadciśnienia często obejmuje podawanie inhibitora enzymu konwertującego angiotensynę, obniżając w ten sposób poziom angiotensyny II, środka zwężającego naczynia krwionośne (Rozdział 42).

Kinetyka enzymatyczna określa odpowiednie warunki przesiewowe

Kinetyka enzymów odgrywa kluczową rolę w odkrywaniu leków. Znajomość zachowania kinetycznego enzymu będącego przedmiotem zainteresowania jest konieczna przede wszystkim w celu wybrania odpowiednich warunków testu do wykrywania obecności inhibitora. Stężenie substratu, na przykład, musi być dostosowane tak, aby wytworzyć wystarczającą ilość produktu, aby umożliwić łatwe wykrycie aktywności enzymu, nie będąc na tyle wysokim, że maskuje obecność inhibitora. Po drugie, kinetyka enzymów dostarcza środków do ilościowego określania i porównywania siły działania różnych inhibitorów oraz określania ich sposobu działania. Inhibitory niekonkurencyjne są szczególnie pożądane, ponieważ – w przeciwieństwie do inhibitorów konkurencyjnych – ich działania nigdy nie mogą być całkowicie przezwyciężone przez zwiększenie stężenia substratu.

Większość leków jest metabolizowana in vivo

Rozwój leku często obejmuje coś więcej niż ocenę kinetyczną interakcji inhibitorów z docelowym enzymem. Na leki mogą oddziaływać enzymy obecne u pacjenta lub patogenu, proces ten określany jest jako metabolizm leków.Na przykład, penicylina i inne antybiotyki beta-laktamowe blokują syntezę ściany komórkowej bakterii poprzez nieodwracalne zatrucie enzymu karboksypeptydazy alanyloalaniny-transpeptydazy. Jednakże wiele bakterii wytwarza β-laktamazy, które hydrolizują krytyczną funkcję β-laktamów w penicylinie i pokrewnych lekach. Jedną ze strategii przezwyciężenia powstałej oporności na antybiotyki jest jednoczesne podawanie inhibitora β-laktamazy z antybiotykiem β-laktamowym.

Transformacja metaboliczna jest czasami wymagana do przekształcenia nieaktywnego prekursora leku lub prolek, w jego biologicznie aktywną formę (Rozdział 53). Kwas 2&prime-deoksy-5-fluorourydylowy, silny inhibitor syntazy tymidylanowej, wspólnego celu chemioterapii nowotworów, jest wytwarzany z 5-fluorouracylu poprzez szereg przemian enzymatycznych katalizowanych przez transferazę fosforybozylową i enzymy dezoksyrybonukleozydu ścieżka ratunkowa (Rozdział 33).Skuteczne projektowanie i podawanie proleków wymaga znajomości kinetyki i mechanizmów enzymów odpowiedzialnych za przekształcanie ich w ich biologicznie aktywne formy.

Badanie kinetyki enzymów i czynników wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy ujawnia poszczególne etapy, za pomocą których enzymy przekształcają substraty w produkty.

&Deltag, całkowita zmiana energii swobodnej dla reakcji, jest niezależna od mechanizmu reakcji i nie dostarcza informacji dotyczących stawki reakcji.

Krówn, stosunek reakcji stałe szybkości, można obliczyć ze stężeń substratów i produktów w równowadze lub ze stosunku k1/k–1. Enzymy nie mają wpływu Krówn.

Reakcje przebiegają poprzez stany przejściowe, dla których &DeltagF to energia aktywacji. Temperatura, stężenie jonów wodorowych, stężenie enzymu, stężenie substratu i inhibitory wpływają na szybkość reakcji katalizowanych enzymami.

Pomiar szybkości reakcji katalizowanej enzymem ogólnie wykorzystuje warunki szybkości początkowej, dla których pozorny brak produktu wyklucza reakcję odwrotną.

Formy liniowe równania Michaelisa-Mentena upraszczają wyznaczanie Km oraz Vmaks.

Liniowa postać równania Hilla jest stosowana do oceny kooperatywnej kinetyki wiązania substratu wykazywanej przez niektóre enzymy multimeryczne. Stok n, współczynnik Hilla, odzwierciedla liczbę, charakter i siłę oddziaływań miejsc wiązania substratu. Wartość n większa niż 1 wskazuje na pozytywną współpracę.

Efekty prostych konkurencyjnych inhibitorów, które zazwyczaj przypominają substraty, są przezwyciężane przez zwiększenie stężenia substratu. Proste niekonkurencyjne inhibitory niższe Vmaks ale nie wpływaj Km.

Dla prostych konkurencyjnych i niekonkurencyjnych inhibitorów stała hamująca Ki jest równa stałej równowagi dysocjacji dla odpowiedniego kompleksu enzym-inhibitor. Prostszym i mniej rygorystycznym terminem oceny skuteczności inhibitora jest IC50, stężenie inhibitora, które powoduje 50% zahamowanie w określonych warunkach eksperymentu.

Substraty można dodawać w kolejności losowej (każdy substrat może łączyć się najpierw z enzymem) lub w kolejności obowiązkowej (substrat A musi wiązać się przed substratem B).

W reakcjach ping-ponga jeden lub więcej produktów jest uwalnianych z enzymu przed dodaniem wszystkich substratów.

Zastosowana kinetyka enzymatyczna ułatwia identyfikację i charakterystykę leków, które selektywnie hamują określone enzymy. Kinetyka enzymatyczna odgrywa zatem centralną i kluczową rolę w odkrywaniu leków, w farmakodynamice porównawczej oraz w określaniu sposobu działania leków.

Cook PF, Cleland WW: Kinetyka i mechanizm enzymatyczny. Garland Science, 2007.

Copelanda RZS: Ocena inhibitorów enzymów w odkrywaniu leków. John Wiley i synowie, 2005.

Kornwalijski-Bowden A: Podstawy kinetyki enzymów. Portland Press Ltd, 2004.

Dixon M: Wyznaczanie stałych inhibitorów enzymów. Biochem J 195355:170.

Dixon M: Graficzne określenie Km oraz Ki. Biochem J 1972129:197.

Ferszt A: Struktura i mechanizm w nauce o białkach: przewodnik po katalizie enzymatycznej i zwijaniu białek. Freeman, 1999.

Fraser CM, Rappuoli R: Zastosowanie genomiki drobnoustrojów do zaawansowanej terapii. Annu Rev Med 200556:459.

Henderson PJF: równanie liniowe opisujące kinetykę stanu stacjonarnego enzymów i cząstek subkomórkowych oddziałujących z ściśle związanymi inhibitorami. Biochem J 1972127:321.

Schramm, VL: Enzymatyczna teoria stanu przejściowego i projektowanie analogów stanu przejściowego. J Biol Chem 2007282:28297.

Schultz AR: Kinetyka enzymatyczna: od diastazy do układów wieloenzymatycznych. Wydawnictwo Uniwersytetu Cambridge, 1994.

Segel IH: Kinetyka enzymatyczna. Wiley Interscience, 1975.

Wlodawer A: Racjonalne podejście do projektowania leków na AIDS poprzez biologię strukturalną. Annu Rev Med 200253:595.

Jeśli jesteś właścicielem praw autorskich do jakichkolwiek materiałów zawartych w naszej witrynie i zamierzasz je usunąć, skontaktuj się z naszym administratorem witryny w celu uzyskania zgody.


Wyniki i dyskusja

Wstępne pomiary szybkości wykazują, że nadtlenek wodoru jest odwracalnym niekonkurencyjnym inhibitorem katalizowanego przez CsOxOx utleniania szczawianów

Inhibicja produktu to szczególny przypadek inhibicji, w którym inhibitor jest również produktem reakcji katalizowanej przez enzym. Typowo badania kinetyczne aktywności enzymatycznej prowadzi się w warunkach, w których ilość produktu obecnego podczas reakcji wynosi skutecznie zero. Usuwa to skutki reakcji odwrotnej tworzących reagenty, jak również te efekty obserwowane przez wiązanie produktu do enzymu, co znacznie upraszcza równanie prędkości i, w przypadku prostego układu jednoreaktantów, daje dobrze znane równanie Michaelisa-Mentena (Równanie 1). Wprowadzenie niezerowych początkowych stężeń produktu ponownie wprowadza zależne od produktu warunki równania prędkości i często pozwala na rozróżnienie między dwoma podobnymi potencjalnymi modelami kinetycznymi. Wykresy Michaelisa-Mentona i Lineweavera-Burka dla różnych stężeń nadtlenku wodoru pokazano odpowiednio na Fig. 1A i 1B. Procent niehamowanej aktywności właściwej i Km wartości dla katalizowanego CsOxOx utleniania szczawianu w obecności i przy braku nadtlenku wodoru mierzone metodą MIMS przedstawiono w tabeli 1. Km aplikacja wartości. Dane te sugerują, że nadtlenek wodoru zachowuje się jak niekonkurencyjny inhibitor CsOxOx. Inhibitory niekonkurencyjne mogą wiązać się z formą enzymu, z którą wiąże się substrat, oraz z różnymi rodzajami enzymów [44, 45]. W klasycznym przypadku niekonkurencyjnym stałe równowagi dla wiązania inhibitora z samym enzymem (Ki) i inhibitor z innym rodzajem enzymu (αKi, opisane poniżej) są równe. Gdy dwie stałe równowagi są różne, tradycyjna nomenklatura hamowania staje się niejednoznaczna, przy czym przypadek ten często definiuje się jako inhibitor „typu mieszanego”, a nie jako inhibitor niekonkurencyjny. Jednak Cleland stwierdza, że ​​skoro nie ma apriorycznie Ponieważ stałe równowagi powinny być równe, hamowanie mieszane powinno być określane jako hamowanie niekonkurencyjne [44]. Zgodnie z tą definicją, niekonkurencyjny inhibitor zmniejszy widoczną prędkość maksymalną, ale może zmniejszyć, zwiększyć lub nie mieć wpływu na widoczną prędkość Km wartość. Wszystkie modele zgodne z tą obserwacją mają nadtlenek wodoru odwracalnie wiążący zarówno sam CsOxOx, jak i inny kompleks CsOxOx.

Wykresy początkowych szybkości utleniania szczawianu przez CsOxOx Michaelisa-Mentena (A) i Lineweavera-Burka (B) pokazujące wpływ różnych początkowych stężeń nadtlenku wodoru: czarny, bez H2O2 czerwony, 2 mM H2O2 niebieski, 4 mM H2O2 zielony, 10 mM H2O2.

Przypisać Kaplikuję i αKaplikuję wartości dla niekonkurencyjnego hamowania obserwowane na Fig. 1A i 1B, eksperymenty przy stężeniach substratu dających wykresy Lineweavera-Burka dla równoodległości i równych punktów wagowych przeprowadzono w szerszym zakresie stężeń nadtlenku wodoru. Otrzymane wykresy wzajemnej początkowej aktywności oksydazy szczawianowej w funkcji wzajemnego stężenia szczawianu dla CsOxOx pokazano na Fig 2A. Ryc. 2B przedstawia drugorzędne wykresy nachyleń i punktów przecięcia odwrotnego wykresu liniowe linie najlepszego dopasowania w funkcji stężenia nadtlenku wodoru. αKaplikuję oraz Kaplikuję wartości szacuje się na 7,91 ± 1,12 i 2,84 ± 1,06 na podstawie wtórnych wykresów przecięcia osi x [44]. Wtórne wykresy nachylenia i przecięcia są liniowe (wartości R2 większe niż 0,99), co sugeruje, że hamowanie nadtlenku wodoru przez CsOxOx jest całkowite (żaden produkt nie jest uwalniany z inhibitora i różnych rodzajów enzymów) i nie jest częściowy (do 40 mM wodoru nadtlenek). Na podstawie tych danych α oszacowano na 2,79 ± 1,12. Sposobem matematycznego sprawdzenia tej wartości jest wykorzystanie linii regresji z wykresów odwrotnych (rys. 2B) [44]. Linie przecinają się w punkcie -0,207±0,011 na osi x i 0,195±0,042 na osi y, co odpowiada wartości α równej 2,25 ± 0,59. Wartości stałej α wyznaczone dwiema różnymi metodami są zgodne.

(A) Wykresy Lineweaver-Burk początkowej aktywności oksydazy szczawianowej w funkcji stężenia szczawianu dla CsOxOx przy zmiennym H2O2 stężenia: koła, bez H2O2 kwadraty, 10 mM H2O2 diamenty, 20 mM H2O2 trójkąty, 40 mM H2O2. (B) Drugorzędne wykresy nachyleń i przecięcia z odwrotnych linii liniowych najlepszego dopasowania (ryc. 2A) w funkcji kół stężenia nadtlenku wodoru, kwadratów nachyleń, przecięcia.

Odwracalne hamowanie niekonkurencyjne i nieodwracalne hamowanie można odróżnić za pomocą wykresu Vmaksymalna aplikacja dane jako funkcja [E]T, gdzie [E]T oznacza całkowitą jednostkę aktywności enzymu dodaną do testu [41]. Te dane dotyczące hamowania nadtlenkiem wodoru katalizowanego przez CsOxOx utleniania szczawianu przedstawiono na ryc. 3. Szybkość tworzenia produktu jest równa produktowi stężenia enzymu i współczynnikowi kinetycznemu, który jest funkcją całego substratu, aktywatora produktu i stężenia inhibitora. Szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie jest zatem liniową funkcją stężenia enzymu z a y-punkt przecięcia 0 i nachylenie f([S], [P], [A], [I]) [42]. Niezerowe x-punkt przecięcia oznacza, że ​​stężenie enzymu zostało zmienione z różnicą x-punkt przecięcia od zera określający stężenie usuniętego lub dodanego aktywnego enzymu. Inhibitory odwracalne z definicji nie dezaktywują enzymu na stałe i dlatego mogą wpływać tylko na nachylenie linii, ale nie na jej x-przechwycić. Na ryc. 3 krzywe z i bez początkowych stężeń nadtlenku wodoru nie wydają się różnić x-przechwytuje. Punkt przecięcia x dla wykresu bez obecnego inhibitora wynosił 7 nM ± 8 nM, a punkt przecięcia x dla wykresu z obecnym inhibitorem wynosił 8 nM ± 9 nM. Te punkty przecięcia z osią x z obu dopasowań liniowych nie różnią się znacząco od siebie i nie różnią się znacząco od zera (jedno odchylenie standardowe od osi x dla obu linii obejmuje zero), co sugeruje, że CsOxOx nie jest dezaktywowany po dodaniu nadtlenku wodoru w ciągu ramy czasowe testu kinetycznego. Ponieważ krzywa z obecnym nadtlenkiem wodoru ma mniejsze nachylenie i przechodzi przez przybliżone pochodzenie, dane te są zgodne z tym, że nadtlenek wodoru jest odwracalnym niekonkurencyjnym inhibitorem katalizowanego przez CsOxOx utleniania szczawianu. W przypadku nieodwracalnego inhibitora nachylenie linii z obecnym inhibitorem miałoby to samo nachylenie i przecinałoby x-osi w pozycji równej ilości enzymu, który jest nieodwracalnie dezaktywowany [41, 42]. Należy zauważyć, że te dane (fig. 3) pokazują, że stężenie nieodwracalnie inaktywowanego enzymu jest pomijalne w warunkach szybkości początkowej.

Każdy punkt reprezentuje a Vmaks aplikacja oznaczenie w pięciu stężeniach szczawianu (0,2, 0,5, 1,0, 5,0 i 10,0 mM).

Generowany przez obrót nadtlenek wodoru prowadzi do inaktywacji CsOxOx

Chromatogramy HPLC monitorujące ilości nadtlenku wodoru i szczawianu w odrębnych punktach czasowych pokazano na Fig 4A (brak katalazy) i 4B (obecność katalazy). Wzorce nadtlenku wodoru, szczawianu i bursztynianu eluowały odpowiednio po 6,3 minuty, 6,9 minuty i 12,4 minuty i odpowiadały przedstawionym przyporządkowaniu pików. W przypadku braku katalazy ilość szczawianu pozostałego po 24 godzinach wynosiła około 85% początkowej ilości (10 mM), a na chromatogramie widoczne było nagromadzenie nadtlenku wodoru. Bliskość piku nadtlenku wodoru i piku szczawianu zakłócała ​​precyzyjną integrację ich odpowiednich obszarów. Po 24 godzinach porcja próbki bez katalazy nie wykazywała wykrywalnej aktywności w teście MIMS, co sugeruje, że obecny CsOxOx został dezaktywowany przez nagromadzenie nadtlenku wodoru generowanego przez obrót. Ponadto dodanie katalazy do inaktywowanego enzymu nie zwraca żadnej aktywnej CsOxOx z obserwowanej inaktywacji. Wyniki te sugerują, że nadtlenek wodoru ma co najmniej dwa oddzielne wpływy na CsOxOx. Po pierwsze, nadtlenek wodoru zachowuje się jak odwracalny niekonkurencyjny inhibitor początkowej szybkości reakcji, jak opisano powyżej. Oddzielnie wydaje się, że nadtlenek wodoru bierze również udział w powolnej inaktywacji enzymu CsOxOx, obserwowanej w minutach do godzin po początkowej przemianie enzymu.

Próbkę reakcji inkubacji bez (A) lub z (B) rekombinowanej katalazy bydlęcej analizowano na początku, 20 minut, 1 godzinę, 2 godziny i 24 godziny.

W celu zaobserwowania wpływu obrotu na CsOxOx, wykres prędkości reakcji po 0 i 2 godzinach obrotu pokazano na ryc. 5. Podobnie do danych na ryc. 3, nachylenie obrotu „traktowanego” (dwie godziny obrotu w obecności 10 mM szczawianu) krzywa szybkości początkowej jest mniejsza niż w przypadku kontroli „nietraktowanej” (bez wcześniejszego obrotu). Sugeruje to, że zaburzenie funkcji kinetycznej jest przynajmniej częściowo spowodowane nagromadzeniem się produktu nadtlenku wodoru podczas dwugodzinnego obrotu. Jednak na Fig. 5 punkt przecięcia osi x krzywej traktowanej obrotem różni się od krzywej kontrolnej. Ta obserwacja jest zgodna z inaktywacją CsOxOx w ciągu dwóch godzin [41, 42]. Inaktywacja enzymu jest widoczna tylko wtedy, gdy enzym jest wstępnie inkubowany ze szczawianem. Wstępna inkubacja w buforze lub buforze i nadtlenku wodoru nie wykazała dezaktywacji. Konkretnie, CsOxOx wstępnie inkubowany z 10 mM nadtlenkiem wodoru przez dwie godziny, a następnie testowany przy końcowych stężeniach 1 mM i 10 mM nadtlenku wodoru dał zmierzone początkowe szybkości, które były współmierne do tych oczekiwanych w badaniach hamowania opisanych powyżej (91,4% i 44,3% niehamowana aktywność specyficzna). Enzym wstępnie inkubowany z 10 mM szczawianem potasu wykazywał mniej niż 20 procent pierwotnej aktywności enzymatycznej po dwóch godzinach (dane nieprzedstawione) i po 24 godzinach nie wykryto żadnej aktywności. Tabela 2 przedstawia wyniki pomiarów MIMS próbek bez wcześniejszej rotacji, rotacji pod nieobecność iw obecności 1,0 mg/ml katalazy bydlęcej, jak opisano w części Materiały i metody. Enzym był dość stabilny w warunkach eksperymentu, przy czym 73% pierwotnej aktywności enzymu pozostało po inkubacji w 25°C przez 24 godziny. Jednak gdy katalaza jest obecna, około 80 procent aktywności enzymu pozostaje po 24 godzinach. Dane te sugerują, że nadtlenek wodoru lub jego pochodna odgrywa kluczową rolę w zależnej od obrotu inaktywacji CsOxOx.

Nie jest od razu oczywiste, w jaki sposób obecność nadtlenku wodoru generowanego przez obrót inaktywuje CsOxOx. Jeden z proponowanych mechanizmów katalizy przez oksydazę szczawianową jęczmienia identyfikuje frakcję enzymu zawierającą Mn 3+ jako aktywną formę enzymu [28]. W tej propozycji, obrót jest inicjowany po związaniu szczawianu z metalowym centrum i przeniesieniu elektronu z ligandu szczawianu do jonu Mn2+. Utrata elektronu ułatwia dekarboksylację ligandu szczawianowego pozostawiając związany z manganem anion rodnika dwutlenku węgla, który proponuje się reagować z tlenem dwuatomowym z wytworzeniem dwutlenku węgla i rodnika hydroperoksylowego. Badania spektroskopowe zgodne z trwałością rodników hydroperoksylowych, które mają kluczowe znaczenie dla obrotu enzymów, potwierdzają tę propozycję. Whitakera i inni postawili hipotezę, że rodnik hydroperoksylowy bezpośrednio ponownie utlenia jon Mn 2+, reaktywując enzym do postaci Mn 3+ w celu dalszej przemiany. Utrata rodnika hydroperoksylowego zapobiegłaby zatem ponownemu utlenieniu centrum metalicznego, czyniąc go nieaktywnym [28]. Podobny mechanizm inaktywacji OxDC został przedstawiony, aby opisać obserwację EPR uwięzionego spinowo rodnika dwutlenku węgla, co sugeruje „nieszczelne” miejsce aktywne, z którego rodnik dwutlenku węgla może się zdysocjować i wejść do roztworu. Ponownie zaproponowano, że w przypadku braku pochłaniania elektronów w miejscu aktywnym, inaktywacja enzymu nastąpi po dysocjacji rodników dwutlenku węgla [33]. Należy zauważyć, że Whitaker i inni mechanizm i obserwacje dotyczące monocupinowej oksydazy szczawianowej jęczmienia mogą nie być dokładne dla CsOxOx. Jedną istotną różnicą jest to, że enzym jęczmienny jest inaktywowany w warunkach beztlenowych w obecności szczawianu i pozostaje taki nawet po ponownym wprowadzeniu tlenu. W przeciwieństwie, CsOxOx, chociaż nieaktywny w warunkach beztlenowych w obecności szczawianu, odzyskuje aktywność po ponownym wprowadzeniu tlenu (dane nie pokazane). Inną istotną różnicą jest to, że obecność katalazy przyspiesza inaktywację enzymu jęczmienia, podczas gdy katalaza chroni przed inaktywacją w CsOxOx. Obserwacje te nie są zgodne z mechanizmem CsOxOx wykorzystującym sam rodnik hydroperoksylowy do regeneracji katalitycznie kompetentnego enzymu i wspierają rolę Mn(II) w redukcyjnej aktywacji tlenu dwuatomowego. Nasze wyniki sugerują zupełnie inną metodę inaktywacji. Obserwujemy, że inaktywacja enzymu następuje podczas obrotu CsOxOx i tylko w obecności nadtlenku wodoru. Sugeruje to, że nadtlenek wodoru reaguje nieodwracalnie z produktem pośrednim obrotu, przez co enzym staje się nieaktywny, co przypomina inaktywację katalazy przez nadtlenek wodoru [46].

Pomiary MIMS ujawniają około 1,3 mola CO2 jest produkowany na 1 mol O2 strawiony. Gdy ten stosunek wykreśla się jako funkcję szczawianu (od 0,5 do 10 mM) w mieszaninie reakcyjnej (Figura C w pliku S1), wynik jest zasadniczo linią poziomą wskazującą, że stosunek jest niezależny od początkowego stężenia szczawianu. Ponadto stosunek CO2 wyprodukowany na 1 mol O2 zużycie jest niezależne od stężenia nadtlenku wodoru (zarówno w początkowych pomiarach szybkości, jak i w przypadku inaktywacji wywołanej obrotem). Pomimo zastosowania licznych technik testowych i dużego zainteresowania stechiometrią tej reakcji, jest to według naszej wiedzy pierwsze doniesienie o zaobserwowanym stosunku stechiometrycznym moli CO2 produkowane na mol O2 spożywany z oksydazy szczawianowej. Doniesiono, że w przypadku sorgo OxOx spożycie szczawianu było bezpośrednio związane z powstawaniem nadtlenku wodoru [6].Zastosowanie technik manometrycznych Warburga do preparatów peroksysomalnych z liści enzymu buraka ćwikłowego nie pozwoliło na ustalenie stechiometrii ze względu na małą ilość zużytego tlenu i powstającego dwutlenku węgla [10]. Pomiary manometryczne szybkości enzymu z pasożytniczego grzyba Tilletia kontrowersyjnie były mylone przez nieczyste preparaty enzymatyczne [47]. Procedury ciekłoscyntylacyjne zostały wykorzystane do powiązania 14 CO2 tworzenie się do zaniku 14 C-szczawianu, ale w tych eksperymentach nie mierzono zużycia tlenu [48]. Co ciekawe, dekarboksylaza szczawianowa z Bacillus subtilis (BsOxDC) został zmutowany (SENS161-4DASN) w celu przeprowadzenia reakcji utleniania i odnotowano stosunek 1,3 moli wytworzonego nadtlenku wodoru do 1 mola utleniania jednego elektronu barwnika ABTS [27]. Ostatnie pomiary MIMS tego mutanta BsOxDC zakładały stosunek 2 moli CO2 jest produkowany na 1 mol O2 spożywane w niskich stężeniach szczawianów [29]. To założenie przyczyniło się do wniosku, że tylko 9% całkowitej liczby miejsc aktywnych mutanta SENS161-4DASN BsOxDC przeprowadza reakcję utleniania z pozostałymi miejscami nieoksydująco dekarboksylującym szczawianem.

Wszystkie wcześniej proponowane schematy mechanistyczne zakładały stosunek molowy 2 do 1 między CO2 produkcja i O2 konsumpcja. To, że stosunek 1,3 do jednego jest obserwowany we wszystkich testowanych warunkach, stwarza możliwość, że może mieć miejsce dodatkowe utlenianie. Jedno z możliwych wyjaśnień może leżeć w losie anionu rodnikowego dwutlenku węgla utworzonego po pierwszej dekarboksylacji. Jak wspomniano powyżej, pułapkowanie spinowe tego gatunku zarówno w CsOxOx, jak i OxDC [25, 32–34] sugeruje, że wycieka on z miejsca aktywnego. Ten rodnik może reagować z rozpuszczonym tlenem z roztworu masowego, tworząc rodnik ponadtlenkowy. Rodniki ponadtlenkowe zostały uwięzione w przypadku katalizowanej OxDC obojętnej dekarboksylacji szczawianu redoks [33]. Ponieważ rodniki ponadtlenkowe (pKa 4,88) w naszych warunkach eksperymentalnych występują głównie jako rodniki hydronadtlenkowe, ucieczka tego gatunku z miejsca aktywnego, a następnie utlenienie egzogennych form, skutkowałaby obserwowanym zwiększonym zużyciem tlenu [28].

Badania dichroizmu kołowego (CD) CsOxOx nie wykazują żadnych globalnych zmian strukturalnych w obecności nadtlenku wodoru

Przeprowadzono eksperymenty CD w celu monitorowania struktury drugorzędowej w funkcji stężenia nadtlenku wodoru i temperatury. Fig 6A pokazuje, że widmo CD dla CsOxOx nie jest zaburzone przez stężenia nadtlenku wodoru do 20 mM. Dane te wskazują, że nadtlenek wodoru nie wpływa na ogólną strukturę białkową enzymu. W przeciwieństwie do tego, wpływ temperatury na widmo CD CsOxOx pokazano na Rys. 6B. Widma pobrane w wyższych temperaturach wykazują głębsze minimum i przesunięcie w kierunku bliskiego obszaru UV. Typowo literaturowe przykłady wpływu temperatury na widmo CD białek wykazują mniejszy stopień eliptyczności molowej wraz ze wzrostem temperatury [49]. Istnieją jednak przykłady, w których widma CD wykazują większy stopień eliptyczności molowej niż CsOxOx [50].